Box-Behnken响应面法优化β-环糊精艾草精油包合物的制备及其性能

钱晓明，王 浩，王立晶，宋 兵，李 芳，王举朝

（天津工业大学 纺织科学与工程学院，天津 300387）

自2019年末新型冠状病毒爆发以来，口罩成为了人们不可或缺的防护品。普通口罩只具备防护、阻隔作用，佩戴4 h后就会滋生大量细菌[1]，市面上具有抗菌功能的口罩大多是添加了无机金属离子，但是无机金属离子抗菌时效较短，还会对人体造成一定伤害，因此限制了其广泛应用，人们逐渐将目光转向天然抗菌剂。艾草精油（wormwood essential oil，WO）是从艾草的茎和叶中提取出来的，提取方式主要有：索氏提取、超临界CO2提取、浸取法、直接煎煮法、乙醇提取法等[2-3]。艾草精油中含有较多的倍半萜和单萜类化学成分[4]，具有广谱抑菌作用和良好的医疗保健作用[5]，但艾草精油具有浓烈香气，容易挥发，易随水蒸气蒸发出油状液体，对空气、阳光较为敏感，不耐酸碱，容易氧化变质且水溶性差[6]，所以它对保存条件要求较高，保质期较短，这就限制了艾草精油的应用场景，故可利用微胶囊技术对其进行包覆，以达到缓慢释放、抗菌耐久的效果。近年来，已有将艾草精油用于纺织品抗菌处理的报道，王辉[7]通过复合凝聚法以明胶和阿拉伯树胶为壁材、艾草精油为芯材，制备了艾草精油微胶囊，并将其应用于棉织物的抗菌整理。吕淑扬[8]制备了耐酸碱的蕲艾精油-丙烯酸树脂微胶囊，并将其用于湿法纺丝，制备了具有抗菌功能的粘胶纤维，使得艾草精油具有抗菌效率更高、抗菌时效持久等优点[9]。

环糊精（cyclodextrin，CD）是一类环状低聚糖，由α-1，4连接的吡喃葡萄糖亚单位组成[10]。CD耐高温，分解温度在300℃左右，自从1998年以来一直在GRAS名单上，无毒无害[11]。最常见的CD有3种类型：α-环糊精（α-CD）、β-环糊精（β-CD）和γ-环糊精（γ-CD），它们分别由6个、7个和8个葡萄糖单元组成[12]，3种CD的腔深约为0.8 nm，但腔的直径是不同的。CD有一个亲水的外表面和一个中空的疏水内部，这个空腔可以容纳另一个亲脂分子（客体）[13]。CD与芯材可以形成摩尔比为1∶1的包合物，如反式肉桂醛[14]、丁醇[15]、肉桂树皮提取物[16]和丁香芽提取物分子[17]等。用CD封装精油的同时，纳米封装技术可以保护活性成分并通过长效缓释控制活性组分的释放，能有效改善其水溶性[18]。这不仅可以掩盖精油刺鼻的味道，还可以防止芯材氧化或热损伤[19]，使得精油在各种环境条件下和较长的时间段内保持有效的抗菌性能[20]。

响应面分析法即响应曲面设计方法（response surface methodology，RSM），是利用合理的试验设计方法并通过实验得到一定数据，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法。考虑到功能性纺织品的天然抗菌应用的有效性和长效性要求，本研究选用β-CD为壁材，通过单因素实验和Box-Behnken响应面法探究最佳反应条件，探究包合物的最高包埋得率的实验条件，以达到长期缓释和长效抗菌性能。

1 实验部分

1.1 实验材料和仪器

材料：艾草精油，招商局健康产业湖北蕲春有限公司产品；无水乙醇，天津市风船化学试剂科技有限公司产品；β-环糊精，上海麦克林生化分析有限公司产品；磷酸二氢钾、磷酸氢二纳、氯化钠，天津市大茂化学试剂厂产品；氯化钾，天津市江天化工技术有限公司产品；氢氧化钠，上海易恩化学试剂有限公司产品。

仪器：DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器，巩义市英峪仪器厂产品；DHG-9070A电热恒温鼓风干燥箱，天津讯赫科技有限公司产品；WE-1水浴恒温振荡器，天津欧诺仪器有限公司产品；FA2204B型分析天平，上海精科天美科学仪器有限公司产品；KQ2200B超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司产品；TG18GK凯特离心机，盐城市凯特实验仪器有限公司产品；UV-2700紫外可见分光光度计，岛津仪器（苏州）有限公司产品；SU1000扫描电子显微镜，日本株式会社日立高新技术那珂事业所产品；Nicolet iS50傅里叶红外光谱仪，赛默飞世尔科技（中国）有限公司产品；STA449F3热重分析仪（TG），德国耐驰公司产品。

1.2 制备方法

图1为β-CD结构与反应机理。

以β-CD为壁材，其分子结构如图1（a）所示，艾草精油（WO）为芯材，采用共沉淀法制备WO-β-CD包合物。按照β-CD在25℃100 mL水中的溶解度[21]称取1.9 gβ-CD，加入100 mL蒸馏水，将其密闭放进恒温加热磁力搅拌器，搅拌速率为400 r/min，加热搅拌1 h，使β-CD充分溶解，制得β-CD水溶液。按照不同壁芯比将定量的艾草精油匀速逐滴加入制得的β-CD水溶液中，继续密闭放入恒温加热磁力搅拌器中，在特定温度下搅拌一段时间，在水溶液中使β-CD和艾草精油充分包埋，然后取出，静置沉淀12 h，抽滤，抽滤所得产物放入烘箱中60℃干燥5 h，即得到艾草精油微胶囊。

图1 β-环糊精结构与反应机理Fig.1 Structure and reaction mechanism ofβ-Cyclodextrin

β-CD具有“内疏水、外亲水”特点，在水溶液中依靠范德华力和氢键的驱动力[22]将艾草精油分子包覆在空腔内，如图1（b）所示。

1.3 单因素实验

（1）不同壁芯比对微胶囊包埋率的影响。在包埋温度40℃、包埋时间4 h的条件下，研究不同壁芯比（1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、7∶1）对微胶囊包埋得率的影响。

（2）不同包埋温度对微胶囊包埋率的影响。在包埋时间4 h、壁芯比为3∶1的条件下，研究不同包埋温度（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃）对微胶囊包埋得率的影响。

（3）不同包埋时间对微胶囊包埋率的影响。在包埋温度40℃、壁芯比为3∶1的条件下，研究不同包埋时间（1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h）对微胶囊包埋得率的影响。

1.4 响应面正交试验设计

在单因素实验的基础上，选取壁芯比（A）、包埋温度（B）、包埋时间（C）作为自变量，分别对以上因素进行编码，并以艾草精油微胶囊包埋得率（Y）为响应值，设计17个实验点的响应面正交试验。

艾草精油微胶囊包埋得率根据下列公式测定：

式中：m1为干燥后的艾草精油微胶囊质量；m2为加入的β-CD质量；m3为加入的艾草精油质量。

1.5 紫外可见分光光度法表征

绘制标准曲线：先配置1 g/L艾草溶液，再稀释至100、200、300、400、500 mg/L，根据艾草精油溶液浓度绘制标准曲线，稀释公式为：

式中：Cq为稀释前浓度；Ch为稀释后浓度。

载油率测定：精确称量40 mg的包合物，溶于4 mL的无水乙醇中，室温下用超声波清洗器超声2 h，吸取2 mL的溶液用1 mol/L的PBS缓冲液稀释5倍，室温下用超声波清洗器超声15 min使其充分混合，混合后使用离心机在转速为8 000 r/min下离心15 min。离心后取上清液，用紫外可见分光光度计测其吸光度，根据标准曲线，将其吸光度换算成相应浓度，从而求出样品中含有的WO的质量，可根据公式（3）求出载油率R：

式中：M为实验初始加入艾草精油的质量；m为样品中含有艾草精油的质量。

1.6 电镜扫描分析（SEM）

将干燥处理后的样品，放在样品台的导电胶上，均匀涂抹后，放进表面处理机中镀金，取出后放进电子显微镜中扫描，调整合适的放大倍数至清晰图像，观察环糊精包埋前后的样貌变化。

1.7 热重分析

分别称取少量的β-CD、WO和包合物样品，使用STA449F3型热重分析仪，在升温速率为10℃/min、升温范围为0~600℃、氮气气体氛围的条件下，进行耐热性测试，得到艾草精油微胶囊的热重分析图。

1.8 缓释性能分析

取50 mL pH=7.4的PBS缓冲液，倒入100 mL的锥形瓶中，称取0.200 g的艾草精油微胶囊样品，将其浸泡于锥形瓶中，放入温度为37℃、振荡频率为80 r/min的恒温摇床中振荡。利用pH=7.4的PBS缓冲液模拟人体液，37℃模拟人体温度，在特定的时间每次取3 mL利用紫外分光光度计测其艾草精油含量。再取3 mL的PBS溶液作为空白液，加入锥形瓶中，放回恒温摇床。用紫外可见分光光度计测其吸光度，将吸光度换算成相应的浓度，求出样品中含有的芯材的量，求出保留率。

1.9 包合物的抗菌性能分析

包合物制备完成后，分别测试其在标准大气下缓释0 d、7 d、30 d的抗菌性能。样品的抗菌性能参考国标GB/T 20944.3—2008《纺织品抗菌性能的评价第3部分：振荡法》以及革兰氏阴性菌大肠杆菌进行抑菌测试。

1.10 数据统计与分析

实验采用Design-Expert 8.0.6软件进行响应面实验设计，采用Origin2018软件进行作图分析。实验数据均为3次平行实验的平均值，结果以±s表示。P＜0.05为具有统计学意义的显著差异。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 不同壁芯比对微胶囊包埋得率的影响

图2为不同壁芯比对微胶囊包埋得率的影响。

图2 不同壁芯比对微胶囊包埋得率的影响Fig.2 Effect of different wall core ratios on embedding yield of microcapsule

由图2可知，壁芯比对艾草精油微胶囊的包埋得率的影响较大。随着β-CD含量的上升，包合物包埋得率先上升，而后逐渐呈下降趋势，在壁芯比为3∶1到达顶峰。出现这种现象的原因可能是，倘若芯材过多，β-CD的空洞结构已经完全被艾草精油填满，无法再包埋过多的精油，从而造成包埋得率的下降和芯材的浪费。因此，在后续设计正交试验，优化工艺的时候，选择壁芯比的水平范围应在2∶1~4∶1较为合适。

2.1.2 不同包埋温度对微胶囊包埋得率的影响

包埋温度对微胶囊包埋得率也有着至关重要的影响。图3为不同包埋温度对包埋得率的影响。

由图3可知，随着温度的增加，艾草精油微胶囊的包埋得率先上升，超过40℃以后，呈现缓慢下降趋势。这可能由于随着温度上升，分子运动剧烈，加速艾草精油进入β-CD的空腔结构，使其充分包合；由于精油是易挥发的热敏性物质，随着温度继续上升，加速精油的分解挥发，造成微胶囊包埋得率的下降。温度为40℃是艾草精油微胶囊的最佳包埋温度，艾草精油微胶囊包埋温度较为适宜的范围是30~50℃。2.1.3不同包埋时间对微胶囊包埋得率的影响

图3 不同包埋温度对包埋得率的影响Fig.3 Effect of different temperatures on embedding yield of inclusion complex

图4为不同包埋时间对艾草精油包埋得率的影响。

图4 不同包埋时间对艾草精油包埋得率的影响Fig.4 Effect of different time on embedding yield of wormwood essential oil

由图4可知，随着包埋时间的增加，艾草精油微胶囊包埋得率先上升而后呈下降趋势。如果包埋时间太短，精油与β-CD混合的不均匀不彻底，艾草精油来不及充分包合进β-CD的空洞结构，造成包埋得率较低；如果包埋时间过长，精油可能损失从而造成包埋率下降。最佳包埋时间在2 h，随着时间继续增加，包埋得率反而呈现下降趋势。所以艾草精油微胶囊的最佳包埋时间范围在1~3 h。

2.2 正交试验结果、方差分析及回归方程建立

由单因素实验选取3水平，设计正交试验，水平和因素的取值如表1所示。

表1 响应面正交试验水平设计表Tab.1 Design of level and factor of response surface methodology test

试验以艾草精油微胶囊包埋产率（Y）作为指标，以心壁比（A）、包埋温度（B）和反应时间（C）为试验因素，试验设计及试验结果如表2所示。

表2 响应面法正交试验表Tab.2 Table of response surface methodology test

以艾草精油微胶囊包埋产率为目标函数值，以壁芯比（A）、反应温度（B）和反应时间（C）为试验因素的编码值为自变量，运用Design-Expert 8.0.6软件对试验结果进行回归拟合，建立包合物包埋工艺的Box-Behnken数学模型，确立艾草精油产率的最优拟合二次多项式方程：Y=75.75+0.77A+0.62B+0.31C+0.035AB+0.078AC-0.12BC-5.58A2-0.25B2+0.35C2。

为了检验方程的有效性，对结果进行方差分析和可信度分析，分别如表3和表4所示。

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

表4 模型可信度分析Tab.4 Model reliability analysis

由表3可知，对于响应值包埋率，模型的P值小于0.05，判断模型显著。由表4可知，模型响应值包埋率的决定系数R2为0.99，校正后R2为0.97，表明模型拟合度高；模型的变异系数小于10%，说明模型对响应值的置信度良好，该模型可以较好地反映真实的实验结果。综上所述，该回归模型对响应值的拟合程度较高，方程能够较好地反映响应值与自变量的关系。

为更直观地反映各因素对响应值的影响，对回归模型进行响应面分析，如图5所示。

图5 实验回归模型Fig.5 Experimental regression model

由图5可见，随着壁芯比的减小，包埋得率先降低后升高。结合表3中三因素P值可知，三因素对包埋得率的影响力由高到低为：壁芯比＞反应温度＞反应时间。经Design-Expert 8.0.6软件分析得出最佳配方为：壁芯比为3∶1，反应温度为40℃，反应时间3 h；相应的模型预测包埋率得为76.4%。再选取预测所得的最佳配比进行复配，测定复配配方的包埋得率，结果为（76.18±0.46）%，实际值与预测值相近，说明该模型能够较好地预测配方最佳配比。

2.3 包合物的紫外分光光度计表征分析

紫外分光光度计是最常用的测量包合物中芯材含量的方法。艾草精油的最大吸收波长是203 nm[8]，利用紫外分光光度计可以测出溶液中的艾草精油含量。

图6为艾草精油在PBS缓冲液中的标准曲线。

图6 艾草精油在PBS（pH=7.4）溶液中的标准曲线Fig.6 Standard curve of wormwood essential oil in PBS（pH=7.4）solution

通过回归分析，艾草精油浓度与紫外吸收光呈线性关系y=0.009 99x+0.031 03，R2为99.97%，拟合度高，其中横坐标是标准液中艾草精油的浓度，纵坐标是不同浓度的标准液在203 nm处的吸光度。

根据公式（3）计算得出，采用壁芯比为3∶1、反应温度为40℃、反应时间3 h制得的包合物载油率为（56.31±0.06）%。

2.4 扫描电镜（SEM）分析

扫描电子显微镜一种新型的电子光学仪器，可以用来分析各种材料的表面形貌特征。环糊精和包合物的电子显微镜扫描图如图7所示。

图7 环糊精和包合物的电镜扫描图Fig.7 SEMof cyclodextrin and inclusion complex

由图7可知，β-CD颗粒较大，呈不规则形状的晶体，一些小颗粒附着在晶体表面，其他研究者也做了相关的报道[23-24]。而包合物颗粒较小且形状统一，呈长方体，具有一定的规整度，符合淀粉包合物颗粒的微观形貌，但团聚现象比较明显，原因可能是包合物在干燥过程中失水导致团聚。

2.5 缓释性能分析

艾草精油、包合物在37℃振荡条件下的缓释曲线如图8所示。

由图8可知，在振荡条件下，艾草精油挥发极快，经过24 h振荡艾草精油含量只剩下（39.36±0.05）%；包合物缓释168 h以后，仍保有50%以上的艾草精油含量，在振荡216 h后包合物中的艾草含量仍有（37.16±0.12）%。艾草精油分子在加热和正当条件下运动加快，符合Brownian运动规律，说明经过β-CD包埋的艾草精油具备了较好的稳定性及较长的保存期限。

2.6 艾草精油微胶囊的热重分析

艾草精油、β-CD和艾草精油微胶囊的热重分析如图9所示。

热失重曲线是一种常规方法，通常用于验证固态复合物的形成，对应于客体分子的热事件（熔点）的全部或部分消失通常被视为复合物形成的证明。由图9可见，空白β-CD空壳与包合物具有相似的热力学曲线，但在100~200℃包合物较β-CD质量损失多5.3%，此阶段正对应WO的热重曲线在72~200℃时开始急剧下滑，5.3%即为损失的WO质量，这表明艾草精油被β-CD成功包合。包合物的热重曲线直到200℃下滑增大，证明相对于艾草精油，包合物的耐热性和热稳定性大幅提高，β-CD对艾草精油起到了保护作用[25]

2.7 抗菌性能测试分析

包合物对大肠杆菌抗菌结果如表5所示。

表5 包合物抗菌实验结果Tab.5 Antibacterial test results of inclusion complex

表5分别测试了包合物在制备完成后，室温下缓释7 d和30 d后的抗菌效果，如图10所示。

图10 不同缓释时间包合物的抗菌效果图Fig.10 Antibacterial effect of inclusion complex with different release time

实验结果表明，包合物在制备完成后抗菌率高达（99.09±0.17）%，经过在标准大气下缓释30 d后抗菌依旧能保持在（95.16±0.53）%，证明包合物能够保护艾草有效成分，能够达到长效抑菌效果。

3 结论

本研究采用饱和溶液法成功将艾草精油包覆在β-CD中形成包合物。为了提高包埋得率，利用响应面法优化了实验条件，并对包合物的载油率、形貌和抗菌性能做了研究，实验发现优化后的包合物提高了艾草精油的耐热性、缓释和长效抑菌的性能。

（1）利用单因素实验和Box-Behnken响应面法实验探究最佳包埋得率，实验结果通过方差分析得到影响包埋得率的显著性顺序为壁芯比＞反应温度＞反应时间，最佳包埋组合是壁芯比为3∶1、反应温度为40℃、反应时间3 h，所制备的包合物包埋得率为（75.4±0.46）%，与响应面回归方程预测值相近。

（2）通过扫描电镜、热重分析和紫外分光光度仪分析证明β-CD与艾草精油的包合物形成。通过电镜观察到包合物相较于环糊精形态有所改变，紫外分光光度仪分析艾草精油被包裹在环糊精内部而不是单纯的混合。

（3）通过缓释和抗菌测试发现，包合物具有缓释且长效抑菌的性能。相较于艾草精油，包合物具有缓释性能，利用PBS缓冲液模拟人体液震荡216 h后包合物中的艾草精油含量为开始时的（37.16±0.12）%，纯艾草精油缓释24 h后仅剩（39.36±0.05）%；包合物形成时，其抗菌率高达99.9%，经过30 d标准大气下的缓释后，其抗菌率保持在（95.16±0.53）%。