高产中性蛋白酶菌株的筛选、优化及中试放大

张文静， 佟晔， 杨锡文， 曹彦金， 魏计东*

1.基因赛奥（大连）生物科技发展有限公司，辽宁大连116620；2.大连市现代农业生产发展服务中心，辽宁大连116014

我国是农业大国，为了提高农作物产量，已研究出了不同种类的化肥，但同时也导致了化肥盲目、过度施用、利用率低等问题。随着资源浪费、土壤污染、环境破坏、食品安全等问题日益严峻，引起了人们广泛的关注[1]。长期施用化肥易导致土地流失、板结和盐渍化现象，进而影响作物产量及质量，不利于我国农业的可持续发展[1-3]。同时，随着中国农业和规模化畜禽养殖业的迅速发展，大量农业废弃物和畜禽粪便加剧了环境污染。据统计，我国农业废弃物（包括玉米秸秆、大豆秸秆、花生秸秆等）年总量约有10 亿t，畜禽粪便年总量高达20 亿t，合计是工业废弃物年总量的4.8倍[3-7]。大量的研究表明添加微生物菌剂进行高温好氧堆肥，可在无公害处理农业废弃物和畜禽粪便肥料化利用的同时，解决化肥污染的问题[5-8]。

蛋白酶（protease，EC 3.4）属于水解酶类，是最重要的三大工业用酶之一，被广泛应用于工业、农业、食品、环保等方面[9-12]。蛋白酶按最适反应pH分类可分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶与碱性蛋白酶3 类，其中中性蛋白酶主要是由微生物发酵提取得到的[11]。但在进行堆肥发酵时往往存在发酵周期长、发酵不彻底等问题，这是由于产蛋白酶菌株是堆肥发酵中重要的功能菌之一，但畜禽粪便中参与发酵的功能型微生物较少[5]。因此，在堆肥中添加微生物菌剂可加快腐熟过程、提升堆肥质量。刘维维等[13]用纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶高产菌株处理堆肥后，其对发酵过程中的碳、氮代谢和腐殖酸的生成有较好的促进作用，可加快腐熟进程，提高堆肥质量。胡红伟等[14]发现添加蛋白酶高产菌株比不添加菌株提前3 天使堆肥样品达到蛋白酶酶活峰值，缩短了堆肥时间。本研究通过在牛粪、猪粪高温发酵时期筛选高产中性蛋白酶菌株，并对其进行发酵条件优化及中试放大，以期为工业化大型设备生产含高产蛋白酶菌株的功能型菌剂奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 牛粪选取内蒙古赤峰市家养牛的牛粪堆肥样品1 种。猪粪选取辽宁省沈阳市六间房村家养猪的猪粪堆肥样品2种。

1.1.2 培养基 LB 培养基：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，蒸馏水1 L，pH 7.0；干酪素发酵培养基：干酪素15 g（适量NaOH 溶液胀溶），K2HPO41.4 g，KH2PO40.7 g；富集培养基：干酪素5 g，酵母粉5 g，K2HPO41.0 g，NaCl 2.0 g，MgSO40.1 g，蒸馏水1 L，pH 7.0；种子培养基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 5 g，蒸馏水1 L，pH 7.2；干酪素发酵培养基：干酪素15 g，K2HPO41.4 g，KH2PO40.7 g，NaCl 5.0 g，MgSO40.1 g，蒸馏水1 L，pH 7.0；干酪素筛选培养基：在干酪素发酵培养基中加20 g琼脂。

1.1.3 仪器与试剂 GUJS-10-50-500 C 型多联全自动发酵罐（镇江东方生物工程设备技术有限责任公司）、L80-EP 高压蒸汽灭菌锅（山东新华医疗器械股份有限公司）、SW-CJ-2 超净工作台（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）、SPX-250B-Z恒温培养箱（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）、HNY-2112B 恒温培养振荡器（天津欧诺仪器股份有限公司）、H1650R 台式高速离心机（湘仪集团）、HH.S21-6 恒温水浴锅（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）、MS-H280-Pro磁力振荡器[大龙兴创实验仪器（北京）股份公司]、UV-5100 紫外分光光度计（上海元析仪器有限公司）。Folin 酚试剂、干酪素、L-酪氨酸均购自国药集团化学试剂有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 富集初筛 分别取样品10 g 于90 mL 有玻璃珠的无菌水中，37 ℃，180 r·min-1震荡 10 min，静置后取上清10 mL 于90 mL 富集培养基中，37 ℃，180 r·min-1培养24 h。取富集培养液用无菌水梯度稀释，取10-3～10-6梯度稀释液，涂布于干酪素筛选培养基，37 ℃倒置培养48 h，挑取生长状况良好的菌株进行多次划线纯化，直至得到单菌落。

1.2.2 复筛 根据干酪素平板水解透明圈法[10，15-17]，选取菌落周围有透明圈的菌株进行点接，根据水解圈直径（D）与菌落直径（d）的比值（D/d）大小确定产中性蛋白酶能力较强的菌株，并将D/d值小的菌株舍弃。

1.2.3 蛋白酶活力测定 挑选4 株透明圈D/d 值较大的菌株，分别刮取一环接种于干酪素发酵培养基，37 ℃，180 r·min-1培养48 h，采用福林酚法[18]测定蛋白酶酶活。

1.2.4 菌种鉴定 形态学、生理生化鉴定：对筛选出的中性蛋白酶酶活最高的菌落进行形态观察，对菌株进行革兰氏染色和显微镜观察，参照《常见细菌系统鉴定手册》[19]进行形态学和生理生化鉴定。16S rDNA鉴定：用试剂盒对菌株总DNA进行PCR 扩增、电泳，胶回收得到纯净的PCR 产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。将测序结果在NCBI 网站上进行Blast 比对，并用MEGA构建系统发育树。

1.2.5 培养温度对产酶活力的影响 ①最优活化温度：分别将种子液置于25、30、37、40、45、50 ℃下，180 r·min-1培养24 h，以1%比例接种于干酪素发酵培养基，37 ℃，180 r·min-1培养48 h后检测酶活。 ②最优发酵温度：将种子液于37℃，180 r·min-1培养24 h，以1%比例接种于干酪素发酵培养基，分别于25、30、37、40、45、50 ℃，180 r·min-1培养48 h后检测酶活。

1.2.6 发酵时间对产酶活力的影响 种子液于37℃，180 r·min-1培养24 h，以1%比例接种于干酪素发酵培养基，30℃，180 r·min-1摇瓶培养8 d，每隔1 d测定酶活。

1.2.7 培养基对产酶活力的影响 以种子培养基与干酪素发酵培养基为初始培养基，分别做蛋白胨、胰蛋白胨与干酪素浓度梯度单因子实验，37 ℃，180 r·min-1活化 24 h，30 ℃，180 r·min-1发酵48 h，测定酶活。

1.2.8 种子液制备 从超低温冰箱中取出甘油法保存的菌株，以0.2%比例接种于LB 培养基，37 ℃，180 r·min-1培养 24 h。种子液对产酶活力影响：挑取目标菌株接于100 mL 种子液，37 ℃，180 r·min-1活化24 h，按1%接种于100 mL干酪素发酵培养基，37 ℃，180 r·min-1发酵 24 h。同时，挑取目标菌落直接接种于100 mL 干酪素发酵培养基，37 ℃，180 r·min-1培养48 h，测定酶活。

1.2.9 50 L种子罐工艺优化 50 L种子罐发酵基本参数：装液量25 L，接种量 4%，LB 培养基，加10 mL消泡剂，温度37℃，初始转速为180 r·min-1，最大转速为240 r·min-1，初始通气量为20 L·min-1，最大通气量为30 L·min-1。发酵过程中实时监测罐内pH 和溶氧浓度（dissolved oxygen，DO），根据实际情况调整转速及通气量，使DO 控制在5%～50%，观察可视窗口，若有大量泡沫则添加消泡剂，发酵24 h。

①接种量优化。分别将种子液按1%、2%、4%、6%、8%、10%比例接种于种子罐，其他条件按照基本参数进行发酵。每2 小时监测OD600吸光度值、糖度，每4 小时取样按GB 20287-2006 监测活菌含量[20]、蛋白酶酶活。

②转速优化。初始转速分别设定为140、160、180、200、220 r·min-1，对应的最大转速分别为 200、220、240、260、280 r·min-1，其他条件按照基本参数进行发酵。每2 小时监测OD600吸光度值、糖度，每4小时监测活菌含量[20]、蛋白酶酶活。

③发酵时间优化。设定发酵时间为32 h，其余条件按照基本参数进行发酵。每2 小时监测OD600吸光度值、糖度，每4 小时监测活菌含量[20]、蛋白酶酶活。

1.2.10 500 L 发酵罐工艺优化 500 L 发酵罐发酵基本参数：装液量250 L，培养基在干酪素发酵培养基中添加1%小麦蛋白粉，按4%比例从种子罐计量移种，加100 mL 消泡剂，温度37 ℃，初始转速为 100 r·min-1，最大转速为 180 r·min-1，初始通气量为10 L·min-1，最大通气量为25 L·min-1，实时监测罐内pH 和DO，根据实际情况调整转速及通气量，使DO在5%～50%，观察可视窗口，若有大量泡沫则添加消泡剂，发酵48 h。

①接种量优化。分别按1%、2%、4%、6%、8%、10%比例接种，其他条件按照基本参数进行发酵。每2 小时监测吸光度值OD600、糖度，每6 小时监测活菌含量[20]、蛋白酶酶活。

③转速优化。初始转速分别设定为80、100、120、140 r·min-1，相对应的最大转速分别为 160、180、200、220 r·min-1，其他条件按照基本参数进行发酵。每2 小时监测OD600吸光度值、糖度，每6小时监测活菌含量[20]、蛋白酶酶活。

④发酵时间优化。设定发酵时间为72 h，其他条件按照基本参数进行发酵。每2 小时监测OD600吸光度值、糖度，每4 小时监测活菌含量[20]、蛋白酶酶活。

2 结果与分析

2.1 菌株筛选

从牛粪及猪粪样品中，共筛选出19 株产中性蛋白酶菌株，分别编号PC1～PC19。通过水解透明圈大小筛选出4株菌株，D/d值由大到小依次为PC2、PC10、PC14、PC1，其中PC2 水解圈直径明显大于菌落直径，其D/d 值最大，为4.25，水解效果最好（表1）。PC2 菌株水解圈如图1 所示。PC1、PC2、PC10、PC14 酶活依次为 5.579、10.74、9.922、7.763 U·mL-1，其中PC2的中性蛋白酶酶活最高。

表1 4种菌株D/d值Table 1 D/d values of four strains

图1 PC2水解透明圈Fig.1 Hydrolyzed transparent circle of PC2

2.2 菌种鉴定

2.2.1 形态学鉴定 菌株PC2的单菌落为微凸起的圆形菌落，黄色，不透明，表面光滑湿润，边缘规则，菌落直径为4 mm 左右。如图2 所示，在光学显微镜下出现短杆状、火柴头状、椭圆透明状3种形态，初步认为是芽孢杆菌，革兰氏染色呈阳性。

图2 PC2镜检图Fig.2 Microscopic photos of PC2

2.2.2 生理生化鉴定 按照《常见细菌系统鉴定手册》[15]对PC2 菌株进行生理生化鉴定，由表2 可知，PC2菌株不产酸但产氨，可利用麦芽糖、淀粉，不可利用乳糖、甘露糖、蔗糖、阿拉伯糖、柠檬酸盐等，V-P 实验、硝酸盐还原、运动性检测、甲基红反应及明胶液化为阳性，脲酶、吲哚实验为阴性，且在NaCl 浓度在2%～10%范围内耐受。菌落形态学特征与显微镜检结果一致，PC2为芽孢杆菌。

表2 PC2生理生化鉴定结果Table 2 Physiological and biochemical identification results of PC2

2.2.3 16S rDNA 鉴定 将测序结果与NCBI 网站上进行Blast 比对，选取同源性96.5%以上菌株的序列，用MEGA 软件进行比对并构建系统发育树（图3），鉴定PC2为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

图3 PC2系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of PC2

2.3 发酵条件优化

2.3.1 种子液对产酶活力影响 由表3 可知，菌落经种子液活化后酶活可达13.92 U·mL-1，与直接发酵（10.17 U·mL-1）相比更高。

表3 种子液对PC2产酶活力影响Table 3 The effect of seed liquid on PC2 enzyme activity

2.3.2 培养温度对产酶活力的影响 如图4 所示，PC2 在发酵温度为30 ℃时酶活达到最高，为15.69 U·mL-1，因此，可确定发酵最佳温度为30℃。如图5所示，种子液活化温度在37 ℃时，PC2酶活达到最高，为15.73 U·mL-1，因此，种子液最佳活化温度为37℃。

图4 发酵液温度对PC2产酶活力的影响Fig.4 The effect of fermentation broth temperature on PC2 enzyme activity

图5 种子液活化温度对PC2产酶活力的影响Fig.5 The effect of activation temperature of seed liquid on PC2 enzyme activity

2.3.3 发酵时间对产酶活力的影响 如图6 所示，在37 ℃活化，30 ℃发酵的条件下，第4 天之前，酶活持续增高，并在第4天达到最大值，第5天酶活开始降低，并上下波动。因此，在此条件下，发酵4 d时产酶效果最好，酶活为18.91 U·mL-1。

图6 发酵时间对PC2产酶活力的影响Fig.6 The effect of fermentation time on PC2 enzyme activity

2.3.4 培养基对产酶活力的影响 经过以种子培养基与干酪素发酵培养基为初始培养基，分别做蛋白胨、胰蛋白胨与干酪素浓度梯度单因素实验，分别得出蛋白胨、胰蛋白胨与干酪素的最佳浓度分别为1%、1%、1.5%，发酵4 d，测定酶活。由表4可知，以LB 培养基为种子液，干酪素发酵培养基为发酵液时，PC2 酶活在发酵第2 天达到最高，为23.57 U·mL-1。

表4 培养基对PC2产酶活力的影响Table 4 The influence of culture medium on PC2 enzyme activity 酶活/(U·mL-1)

2.4 中试放大

2.4.1 50 L 种子罐 由图7 可知，在接种量为4%时，发酵24 h 的活菌含量、酶活均最高，且高于接种量为2%的摇瓶培养，此时的活菌含量为18.73亿·mL-1，酶活为21.78 U·mL-1，表明50 L种子罐发酵的最优接种量为4%。由图8 可知，在200 r·min-1≤最大转速≤240 r·min-1时，活菌含量及酶活均有所上升，并同时在最大转速为240 r·min-1时达到最大值，分别为 18.86 亿·mL-1、22.33 U·mL-1，在 240 r·min-1＜最大转速≤280 r·min-1时，活菌含量及酶活均有所下降，表明50 L 种子罐发酵的最优转速为初始转速180 r·min-1，最大转速240 r·min-1。由图 9 可知，检测每 2 小时活菌含量、蛋白酶酶活结果表明，0～8 h为迟缓期，菌株生长缓慢，无酶活；8～22 h 为对数生长期，菌株大量繁殖，酶活开始上升，活菌含量在22 h 达到最高，为 19.67 亿·mL-1；22～32 h 为稳定期，活菌含量基本且稳定，酶活在24 h达到最高，为9.636 U·mL-1。由于活菌数在22 h 达到最高，24 h 时的活菌数与其无明显差异，因此选取50 L 种子罐发酵的最优发酵时间为24 h。

图7 50 L种子罐接种量优化Fig.7 Optimization of inoculation volume of 50 L seed tank

图8 50 L种子罐转速优化Fig.8 Speed optimization of 50 L seed tank

图9 50 L种子罐发酵时间优化Fig.9 Optimization of fermentation time of 50 L seed tank

2.4.2 500 L 发酵罐 由图10 可知，接种量4%时活菌含量及酶活均最高，分别为44.23 亿·mL-1、27.67 U·mL-1，表明 500 L 发酵罐发酵的最优接种量为 4%。由图 11 可知，在 160 r·min-1≤最大转速＜180 r·min-1时，活菌含量及酶活均有所上升，并同时在最大转速为180 r·min-1时达到最大值，分别为 44.52 亿·mL-1、28.34 U·mL-1；在 180 r·min-1＜最大转速≤220 r·min-1时，活菌含量及酶活均有所下降，表明500 L 发酵罐发酵的最优转速为初始转速 100 r·min-1，最大转速 180 r·min-1。发酵每4小时活菌含量、蛋白酶酶活如图12所示，0～16 h 为迟缓期，菌株生长缓慢，无酶活；16～52 h为对数生长期，菌株大量繁殖，且酶活开始上升，活菌含量在52 h达到最高，为44.68亿·mL-1，酶活在 48 h 达到最高，为 29.48 U·mL-1；52～72 h 为稳定期，活菌含量基本稳定。由于活菌数在52 h 达到最高，酶活在48 h达到最高，而48 h时的活菌数为44.58 亿·mL-1，与最高值44.68 亿·mL-1差异无统计学意义，为降低发酵能耗和成本，确定500 L发酵罐发酵的最优发酵时间为48 h。

图10 500 L罐接种量优化Fig.10 Optimization of inoculation volume of 500 L tank

图11 500 L罐转速优化Fig.11 Speed optimization of 500 L tank

图12 500 L罐发酵时间优化Fig.12 Optimization of fermentation time of 500 L tank

3 讨论

蛋白质是农业废弃物和畜禽粪便中的主要物质之一[5,11]，本研究采用以干酪素为唯一碳源的筛选方式，从牛粪及猪粪堆肥样品中筛选出19 株产蛋白酶菌株，复筛后选取4 株高产中性蛋白酶菌株，其中 PC2 酶活最高，为 10.74 U·mL-1，水解圈D/d值为4.25。结合形态学鉴定、生理生化鉴定以及16S rDNA 分子生物学鉴定结果，认定PC2 为枯草芽孢杆菌。根据其菌种特性，对其进行了多次发酵条件优化，最终确定摇瓶发酵参数为：以LB培养基37℃、180 r·min-1活化24 h，按1%比例接种于干酪素发酵培养基，30℃、180 r·min-1培养2 d时达到最大酶活，为23.57 U·mL-1。此外，对PC2进行了发酵中试放大，分别进行了50 L 单罐发酵与50 L 和500 L 联合发酵试验，探索出了50 L 种子罐和500 L 发酵罐的发酵参数。50 和500 L 联合发酵结束后活菌含量为44.58 亿·mL-1，酶活为29.48 U·mL-1，是初始筛菌酶活（10.74 U·mL-1）的2.745 倍 ，是 摇 瓶 优 化 酶 活（23.57 U·mL-1）的1.251倍。

目前已发现的产蛋白酶的微生物主要有细菌、霉菌和放线菌，细菌中芽孢杆菌是产中性蛋白酶的主要菌属之一[21-23]。研究表明，芽孢杆菌中的多种细菌均具有产蛋白酶能力，主要包括解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌等[24]。本研究中的PC2 为枯草芽孢杆菌，与以往研究报道的具有高产中性蛋白酶能力的芽孢杆菌一致，且是敖静等[5]在鸡粪中筛选到的枯草芽孢杆菌蛋白酶活力的1.134 倍。但后续还需对PC2 菌株所产蛋白酶的酶活性质进行研究，以找到该酶最适作用条件，尤其是酶的作用温度。从产酶条件上看，PC2 在高温下的蛋白酶活性有所上升，说明此酶在高温条件下具有更高酶活的可能性较高，可更好地适用于堆肥发酵；同时，本研究提供了PC2这一高产中性蛋白酶菌株的摇瓶发酵参数及50 L 和500 L 中试发酵参数，为大型发酵生产技术提供了初步理论与实践基础，对工业化生产含产蛋白酶菌株的微生物菌剂，从而对改善和解决化肥滥用问题具有重大意义。