葛根及含葛根复方对重症肌无力大鼠骨骼肌及线粒体动力相关蛋白1的影响

彭高强 文颖娟 陈茉 仝武宁

重症肌无力(myasthenia gravis, MG)是一种影响骨骼肌神经肌肉接头的自身免疫性疾病，其特征为波动性肌无力，常累及眼肌、咽喉及四肢，具有晨轻暮重，活动后加重，休息时减轻，可发生于全身各个骨骼肌的特点[1]。目前治疗MG没有特效药，一般采取对症治疗，如胆碱酯酶抑制剂、免疫抑制治疗等。

中医无重症肌无力这一说法，但根据其主要表现为肢肉活动无力而将其纳入“痿症”范畴。主要是由于脾虚或痰湿瘀血等浊邪阻滞中焦，导致脾不能输布散津至四肢肌肉而表现出四肢肌肉收缩无力或偏废不用的临床症状，以脾虚为本，浊邪阻滞为标，病机总属于虚实夹杂[2-3]。动力相关蛋白1(dynamin-related protein 1, Drp1)是调控线粒体分裂的一种蛋白，对线粒体分裂起主要作用，线粒体分裂增加会使网状结构发生改变，线粒体片段化增多、细胞内Ca2+紊乱以及活性氧的大量产生从而导致线粒体的损伤[4-5]，研究表明，抑制大鼠骨骼肌中线粒体Drp1蛋白表达，可以减少线粒体的过度分裂，从而对线粒体功能的改善，骨骼肌收缩能力有一定的积极作用[6]，前期实验研究表明葛根及其复方能够改善重症肌无力大鼠骨骼肌肌力及线粒体功能[3, 7]。在此基础上，本实验观察葛根及其复方对实验性自身免疫性重症肌无力大鼠骨骼肌组织及线粒体Drp1蛋白影响，以进一步明确葛根治疗MG的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

80只SPF级Lewis大鼠，雌性，体质量为(160～180)g，精神状况良好，由成都达硕实验动物有限公司提供，动物许可证号：SCXK(川)2020-030。本实验通过陕西中医药大学伦理审查，动物伦理编号：SUCM-DL20210621001。

1.2 实验处方与药物

葛根方：葛根20 g；葛芪方：黄芪15 g、葛根20 g；葛参方： 丹参15 g 、葛根20 g；葛妙方：牛膝15 g、黄柏15 g、薏苡仁15 g、苍术15 g、葛根20 g；葛芪参妙方：牛膝15 g、黄柏15 g、薏苡仁15 g、黄芪15 g、苍术15 g、葛根20 g。中药饮片由陕西中医药大学校医院提供。阳性对照组药物：强的松龙(由天津药业集团新郑股份有限公司提供)。

1.3 实验试剂

鼠源性AchR-α亚基97-116肽段序列(货号：C8385FE270-1，金斯瑞生物科技股份有限公司)、2.5%磷酸盐缓冲液(PBS，货号：ZLI-9062，赛默飞世尔科技公司)、完全福氏剂(货号：F5881)、不完全福氏剂(货号：F5506，美国sigma公司)。一抗、二抗稀释液(货号：WB0158、WB0159)、蛋白定量试剂盒(货号：WB2123)等均来自上海威奥公司。组织匀浆器、脱色摇床、全波长酶波仪等均由陕西中医药大学实验室提供。

1.4 分组造模

大鼠购买后于陕西中医药大学动物房适应性饲养1周，然后随机将大鼠分为空白组、模型组、葛芪组、葛参组、葛妙组、葛根组、葛芪参妙组、强的松组，共8组，每组各10只。进行造模，将肽段、PBS、完全福氏剂三者按照1∶1.5∶1.5的比例混合制成乳剂；取除空白组以外的大鼠，分别在其后足底、腹部、背部浅表组织注射入200 μL(含肽段100 μg)乳剂进行造模，用相同剂量的PBS注射空白组。30天后进行第二次免疫，将肽段、PBS、不完全福氏剂三者按照1∶3∶3的比例混合成免疫乳剂，再次皮下注射200 μL(含肽段50 μg)乳剂以强化免疫造模大鼠，空白组注射同量的PBS。

1.5 给药方法

造模成功后，给予模型组、空白组生理盐水灌胃，3 mL/次。葛根复方组与强的松组按照人鼠剂量公式换算，葛根组为2.08 g/(kg·d)，葛芪组3.65 g/(kg·d),葛参组3.65 g/(kg·d),葛妙组8.33 g/(kg·d)，葛芪参妙组11.46 g/(kg·d) ，强的松组给予5.4 mg/(kg·d)。每日灌胃1次，连续28天。

1.6 取材及检测

1.6.1 苏木精—伊红染色法(hematoxylin-eosin staining, HE)对骨骼肌组织的观察 给药28天后，禁食12小时，随机从每组大鼠选取5只并给予大鼠腹腔麻醉，将大鼠处死，沿着坐骨神经走向分离出骨骼肌并将其切成小块，然后使用固定液对组织进行固定，再经石蜡包埋将包埋好的骨骼肌组织进行病理切片(切片厚度为3 μm～4 μm)、脱水、染色、封片等步骤，再通过显微镜下观察组织的变化。

1.6.2 透射电镜观察大鼠骨骼肌线粒体超微结构变化 将大鼠骨骼肌组织分成小块，经PBS、四氧化锇固定、梯度乙醇脱水、组织包埋后，于透射电镜观察下观察线粒的超微结构。

1.6.3 蛋白印迹法检测大鼠各组骨骼肌Drp1蛋白的表达 取大鼠各组骨骼肌组织剪切成细小的碎片，然后按每20 mg组织加入100 μL裂解液的比例加入裂解液，经离心、电泳、转膜、孵育后对Drp1蛋白进行显影拍照并分析条带的灰度值。

1.7 统计方法

2 结果

2.1 大鼠骨骼肌病理组织变化

由图看出，空白组大鼠骨骼肌组织完整、无断裂、无肿胀、细胞核排列整齐。较空白组而言模型组骨骼肌肌纤维排列紊乱有断裂现象、细胞核排列不规则并有炎症细胞浸润。与模型组相比，药物治疗各组骨骼肌肌纤维紊乱断裂以及紧密度现象都有一定程度改善，细胞核偏移、炎症浸润逐渐减少，其中以葛芪参妙组效果最优，见图1。

2.2 电镜下各组大鼠骨骼肌线粒体变化情况

由图看出，空白组大鼠骨骼肌线粒体排列整齐，呈长椭圆形，线粒体与肌节平行，线粒体结构清晰可见。模型组大鼠骨骼肌线粒体出现肿胀变形，线粒体嵴断裂、模糊不清甚至形成空泡。葛根组大鼠骨骼肌线粒体排列较整齐，部分线粒体有肿胀、变形、线粒体嵴紊乱及外膜破裂现象。葛芪组骨骼肌肌节较清晰，线粒体部分发生了肿胀、基质减少、外膜破坏及小范围空泡的形成。葛参组肌纤维间隙增大、部分线粒体也出现了溶胀变大。葛妙组能够观察到线粒体形态被拉长、肿胀、溶解。葛芪参妙组线粒体总体排列整齐、线粒体膜结构完整、结构清晰，只有少量线粒体出现了肿胀。强的松组能够观察到骨骼肌肌纤维之间有明显的间隙，肌节排列相对不平行，较多的线粒体出现了溶解、肿胀、嵴紊乱、基质减少。总而言之，和模型组相比，治疗各组肌纤维紧密度、肌节平行度有所改善、线粒体肿胀程度、空泡化、嵴紊乱情况都有不同程度缓解，其中以葛芪参妙组恢复效果最优，见图2。

注：A 空白组； B 模型组；C 葛根组；D 葛芪组；E 葛参组；F 葛妙组；G 葛芪参妙组；H 强的松组。

注：A 空白组； B 模型组；C 葛根组；D 葛芪组；E 葛参组；F 葛妙组；G 葛芪参妙组；H 强的松组。

2.3 各组小鼠骨骼肌线粒体Drp1蛋白的比较

图3、表1结果显示：空白组Drp1蛋白明显低于其余各组骨骼肌中Drp1蛋白表达，差异具有统计意义(P<0.01)；与模型组相比，药物干预组中Drp1蛋白有不同程度降低(P<0.05)，其中以葛妙、葛芪参妙组中Drp1蛋白表达降低幅度最大(P<0.01)，优于强的松组(P<0.01)，葛根组、葛芪组与强的松组组间无明显差异(P>0.05)。表明了葛根复方能够调节大鼠骨骼肌组织中线粒体Drp1蛋白表达。

表1 各组大鼠骨骼肌Drp1蛋白表达比较

图3 各组大鼠线粒体Drp1蛋白表达情况

3 讨论

中医根据MG主要以四肢筋脉松弛无力，不能随意运动或伴有肌肉萎缩的临床表现将其纳入“痿症”范畴。中医认为，脾主运化，为气血生化之源，脾健则气血等精微物质才能充养脏腑经络、四肢百骸才能发挥正常的生理活动；脾虚会导致痰湿、瘀血不化，进而导致肌肉组织得不到精微物质濡养而出现肢体不用的情况，故普遍认为脾虚兼痰瘀浊邪内阻是MG发病的主要原因，其病机多为虚实夹杂[2-3]。《松峰说疫》云：“脾主肌肉，外应四肢，肌肉痿，行善瘈，脚下痛。脾太过则令四肢不举。”由此为MG从脾治疗提供了理论依据。雷孝文[8]观察到通过益气健脾法能够有效改善重症肌无力大鼠骨骼肌线粒体能量代谢，从而起到治疗MG的作用。由此证明，脾虚引起骨骼和线粒体异常是MG发病重要原因。因此，本研究选取葛根为主药药物进行研究(葛根甘、辛，归于脾胃经，具有祛邪和扶正作用，与MG发病机制相对应[9])，考虑到脾的功能减退不但容易使肌肉组织失去濡养还容易因运化无力导致气血阻滞，痰瘀等病理产物堆积形成，进而导致MG在疾病的发展过程中形成“因虚致实、虚实夹杂”的局面。以往对MG的实验多从补虚入手，少有从补虚泻实法治疗MG的实验，故本实验分别佐以健脾的黄芪、活血的丹参、清热祛湿的四妙散，以观察葛根复方对MG大鼠骨骼肌及线粒体的影响。由于Drp1蛋白在骨骼肌过度表达会使骨骼肌中线粒体能量代谢紊乱，导致肌肉质量、运动能力降低[10]。由此可以看出Drp1蛋白高表达可能跟肌肉受损存在着重要联系。为此本实验也对Drp1蛋白表达进行了检测，本研究发现模型组骨骼肌组织及线粒体结构损伤、Drp1蛋白表达明显高于空白组。总而言之，Drp1蛋白表达结果与病理组织及电镜结果总体一致，但值得指出的是葛妙组中骨骼肌病理组织及线粒体结构恢复不及葛芪参妙组，而在蛋白印迹法检测Drp1蛋白显示二者并无明显差异。出现这原因笔者分析可能有两点：一是分裂蛋白Drp1表达开始下降，线粒体结构还尚未恢复；二是蛋白表达测量时可能存在一定的误差。结合电镜结果可以看出重症肌无力会促使骨骼肌线粒体分裂从而引起线粒体质量受损，经葛根复方治疗后线粒体结构有所好转，Drp1蛋白表达量也逐渐下降并向空白组靠近，其中以葛芪参妙组最明显，由此说明葛根复方可抑制Drp1蛋白表达、降低线粒体的分裂程度，促进线粒体质量的恢复。从中医角度分析，葛根虽有扶正祛邪的功效，但药物单一，故疗效一般。而葛芪参妙组由葛根、黄芪、丹参、四妙散组成的复方，具有益气活血、通络祛湿作用，增强了葛根扶正祛邪的功效，更符合MG“虚实夹杂”的病因病机，所以疗效更显著。

综上，本实验揭示了葛根复方在重症肌无力大鼠模型性中具有降低Drp1蛋白表达、减少线粒体的分裂、促进线粒体恢复和改善骨骼肌组织的功效。由于线粒体融合蛋白、分裂蛋白是维持线粒体功能的重要蛋白，本实验只对线粒体分裂蛋白进行检测，未对融合蛋白检测，故存在一定的不足，因此在以后的实验将对融合蛋白进行研究。