益气化瘀解毒方对脂多糖诱导的急性呼吸窘迫综合征模型大鼠Cav-1/IL-12/IL-13表达的影响

邹乔 李雁 陈一凡 孔煜荣 陈瑜

急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是由多种肺内(如肺炎、误吸等)或肺外因素引起的，以难治性低氧血症和进行性呼吸窘迫为主要表现的临床急危重症。流行病学调查数据显示，中国每年约有67万ARDS患者，全球范围内ARDS的病死率为30%～40%[1]。目前，临床仅以保护性俯卧位机械通气作为较高等级证据支持的治疗措施，仍亟需安全有效的防治手段进行干预[2]。Meta分析研究表明，中西医结合治疗ARDS在降低病死率、减少平均机械通气时间、改善氧合指数、下调促炎因子等方面优势明显[3]。

本实验所采用的益气化瘀解毒方为全国名老中医药专家、首都国医名师杜怀棠教授根据多年临床诊疗经验，针对ARDS肺气虚衰，毒瘀闭肺[4]的关键病机而创设的经验方。前期实验研究发现，益气化瘀解毒方中剂量组(即本实验中药复方组采用的剂量)可显著调节脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的ARDS模型大鼠炎症通路蛋白核因子NF-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)p65/p50、NF-κB抑制因子α(inhibitor of NF-κB，IκBα)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)及炎症因子白细胞介素(interleukin, IL)-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的表达水平[5-8]；又运用生物信息学方法分析[9]，推测本方可能通过上调小窝蛋白-1(caveolin-1, Cav-1)而干预ARDS炎症级联反应。因此，本研究通过观察益气化瘀解毒方对ARDS模型大鼠Cav-1蛋白及炎症因子IL-12、IL-13表达水平的影响，探讨益气化瘀解毒方调控ARDS炎症反应的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康SPF级雄性SD大鼠18只，6～7周龄，体质量(180±10)g，北京华阜康生物科技股份有限公司提供，实验动物许可证号：SCXK(京)2019-0008，于北京中医药大学东直门医院实验动物中心屏障实验室分笼饲养，每笼6只，普通饮食。适应性喂养3天后开始实验。本次动物实验研究通过北京中医药大学东直门医院实验动物福利与伦理委员会审批，编号：19-54。

1.2 实验药物

中药复方(包括黄芪30 g、黄芩10 g、金银花15 g、三七10 g、赤芍15 g、炒枳实12 g、葶苈子15 g、桑白皮15 g，由中国中医科学院中药研究所提供并制成中药浸膏，批号：20191030)。

1.3 主要试剂与仪器

大肠杆菌LPS(Sigma，L6511)；Caveolin-1 rabbit polyclonal antibody(Proteintech，16447-1-AP)；大鼠Cav-1 ELISA试剂盒(江苏酶标生物科技有限公司，MB-7123A)大鼠IL-12 ELISA试剂盒(江苏酶标生物科技有限公司，MB-7125B)；大鼠IL-13 ELISA试剂盒(江苏酶标生物科技有限公司，MB-1626B)；BH2光学显微镜(OLYMPUS)；高速离心机(Thermo)；Varioskan Flash光谱扫描多功能读数仪(Thermo Scientific)。

1.4 动物分组、给药与造模

将SD大鼠随机分为对照组、模型组、中药复方组3组，每组6只。结合既往实验研究确定的最佳造模时间、剂量与给药剂量，按12.2 g/(kg·d)(给药剂量为生药剂量)用蒸馏水将中药浸膏配制为中药溶液，予中药复方组大鼠每日灌胃给药，对照组、模型组大鼠灌服等量蒸馏水，均用60℃温水浴加热后灌胃，灌胃量1 mL/(100 g·d)，每日1次，连续7日。第7日灌胃后6小时，模型组、中药复方组一次性尾静脉注射LPS溶液(2 mg/kg)，对照组尾静脉注射0.9%氯化钠注射液(2 mg/kg)，16小时后3%戊巴比妥钠(0.1 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠。

1.5 标本采集与观测指标

1.5.1 肺组织病理 充分暴露大鼠胸腔，摘取全肺，分离右下肺制作病理切片，经组织切片、常规脱蜡、苏木精—伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色、分色、脱水、封片等步骤，在光学显微镜下观察各组肺泡与肺间质形态、充血水肿及炎症细胞浸润程度等肺组织病理情况。肺组织病理切片及HE染色均在北京中医药大学科研实验中心形态学检测平台制作完成。

1.5.2 酶联免疫法(enzyme lirked immunosorbent assay,ELISA)检测肺泡灌洗液、肺匀浆Cav-1及血清IL-12、IL-13表达水平 大鼠开胸结扎右肺门后，用PBS反复3次进行左支气管肺泡灌洗，回收肺泡灌洗液，经3 000 r/分钟、4℃离心10分钟后，取上清液置于-80℃冰箱中保存备用；分离右上肺，剪碎肺组织样本，加入组织裂解液，冰水混合物中行组织匀浆，经12 000 r/分钟、4℃离心5分钟后，取上清液置于-80℃冰箱中保存备用；打开腹腔，暴露腹主动脉，取腹主动脉血3～5 mL于肝素化试管中，经3 000 r/分钟、4℃离心20分钟后，取血清置于-80℃冰箱中保存备用。按照ELISA试剂盒操作说明进行测定。检测肺泡灌洗液Cav-1及血清IL-12、IL-13表达水平时，将肺泡灌洗液、血清样本PBS稀释5倍后测定；检测肺匀浆Cav-1表达水平时，将肺匀浆样本用PBS稀释200倍后测定。

1.5.3 蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测肺匀浆Cav-1表达水平 提取肺组织总蛋白，10 000 r/分钟、4℃离心15分钟，BCA法测定蛋白浓度。取等量蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，浓缩胶部分80 V、30分钟，观察跑到分离胶部分以后，120 V、90分钟；转膜用80 V、70分钟；5%的脱脂奶粉室温封闭1小时。加入一抗稀释液，稀释的一抗抗体(1∶2 000)，孵育、洗涤，再加入相应二抗(1∶10 000)，ECL化学发光检测，暗室中显影。采用成像分析系统Quantity One测量并记录图像灰度值。

1.6 数据处理

2 结果

2.1 大鼠肺组织病理观察结果

对照组大鼠肺组织病理可见肺泡结构清晰完整，肺泡腔及间质无充血水肿，未见炎性细胞浸润；模型组大鼠肺泡腔及间质结构变形，肺泡壁增厚，部分肺泡塌陷，可见炎性渗出；中药复方组较模型组大鼠肺组织损伤程度减轻，炎性渗出及出血较少，肺泡结构较完整，塌陷较少。见图1。

注：×200：A 对照组；B 模型组；C 中药复方组；×400：D 对照组；E 模型组；F 中药复方组。

2.2 ELISA法检测大鼠肺泡灌洗液、肺匀浆Cav-1蛋白表达情况

肺泡灌洗液中，与对照组相比，模型组Cav-1水平显著减少(P<0.01)；与模型组相比，中药复方组Cav-1水平显著增多(P<0.05)。肺匀浆中，与对照组相比，模型组Cav-1水平显著减少(P<0.01)；与模型组相比，中药复方组Cav-1水平显著增多(P<0.01)。见表1。

表1 各组ARDS模型大鼠肺泡灌洗液、肺匀浆中Cav-1蛋白表达水平比较(ELISA法)

2.3 Western Blot法检测大鼠肺匀浆Cav-1蛋白表达情况

肺匀浆中，与对照组相比，模型组Cav-1表达显著下调(P<0.01)；与模型组相比，中药复方组Cav-1表达显著上调(P<0.01)。见表2及图2。

表2 各组ARDS模型大鼠肺匀浆Cav-1蛋白表达水平比较

图2 各组ARDS模型大鼠肺匀浆Cav-1蛋白表达情况

2.4 大鼠血清IL-12、IL-13表达情况

与对照组相比，模型组IL-12水平显著升高(P<0.01)；与模型组相比，中药复方组IL-12水平显著降低(P<0.01)；与对照组相比，模型组、中药复方组IL-13水平显著升高(P<0.05，P<0.01)。见表3。

表3 各组大鼠ELISA检测血清IL-12、IL-13表达水平比较

3 讨论

3.1 Cav-1/IL-12/IL-13在LPS诱导的ARDS发病中的作用

脓毒症是ARDS最常见、最严重的病因之一，严重感染者有25%～50%发生ARDS，病死率高达70%～90%[10]。其发病主要由革兰氏阴性杆菌侵袭所致，LPS为革兰氏阴性杆菌细胞壁的主要成分之一，故本实验采用基础研究中广泛应用的LPS尾静脉注射进行造模，模型组大鼠肺组织病理可见ARDS典型特点，表明复制ARDS模型成功。

Cav-1是一种22 kDa的跨膜支架蛋白，在肺损伤的发病机制中起着至关重要的作用[11]。研究发现，Cav-1蛋白表达水平的下调常伴随ARDS相关炎症因子及NF-κB等炎症通路相关蛋白表达水平的上调[12-15]。LPS可激活Cav-1[16]，使其与LPS受体Toll样受体4相互作用，降解IκBα，活化NF-κB，并从细胞质转移到细胞核内，启动一系列炎症因子转录及爆发性表达，引起肺内以巨噬细胞和中性粒细胞为主的炎症细胞浸润，破坏肺组织正常结构及功能。本实验中模型组大鼠肺泡灌洗液、肺匀浆中Cav-1蛋白表达水平均较对照组明显下调，说明Cav-1减少在ARDS发病中具有重要意义。

炎症因子IL-12、IL-13主要由活化的单核/巨噬细胞产生。研究发现，LPS刺激可分别引起肺组织、血浆中促炎因子IL-12及抑炎因子IL-13表达增加[17-18]。同时，抑炎因子IL-4、IL-10、IL-13可抑制IL-12、γ干扰素、TNF-α的产生[19]，而IL-12除促进炎症因子γ干扰素表达形成正反馈外，也可抑制IL-4、IL-13的表达[20]，因此IL-12/IL-13的表达常处于一定的平衡。LPS诱导全身炎症反应所致的ARDS可能与促炎因子IL-12与抑炎因子IL-13的表达失衡有关。本实验中模型组IL-12、IL-13较对照组均升高，与既往研究结果一致，说明ARDS发病过程中炎症级联反应的出现可能与促炎与抑炎因子表达水平的变化密切相关。

3.2 益气化瘀解毒方防治ARDS作用机理分析

中医学在历代发展中积累了丰富的急救医疗经验，根据ARDS的临床表现，可将其归属于“喘脱”“暴喘”等范畴[21]。本病多因患者感受邪毒，壅滞于肺，肺失宣肃，水道不通，饮热互结，百脉不畅，瘀血内阻，痹肺伤肺而发病。益气化瘀解毒方用生黄芪益气扶正，祛邪防变；金银花、黄芩清热解毒，透邪外出；桑白皮、葶苈子、枳实泻肺逐饮，降气平喘；三七、赤芍化瘀通络，凉血解毒。全方扶正祛邪兼顾，化瘀解毒而不伤正，益气扶正而不碍邪。

本实验中药复方组大鼠肺组织病理可见肺损伤程度明显减轻，表明中药复方对ARDS可起到良好的防治效果。中药复方组Cav-1蛋白表达水平较模型组显著上调，促炎因子IL-12表达水平较模型组明显减少；中药复方组与模型组抑炎因子IL-13表达水平均较对照组升高，说明益气化瘀解毒方能上调Cav-1水平，增加抑炎因子表达，减少促炎因子表达，起到减轻炎症反应、降低肺损伤的作用。关于中药复方是否通过Cav-1蛋白对ARDS炎症级联反应起到关键调控作用的直接证据仍有待在今后的实验中进一步阐明。