硫化氢对血管性痴呆大鼠缺血再灌注损伤中NLRP3表达的影响

章亚明 田茂 郑菊 肖雁

(1贵州医科大学分子生物学重点实验室 地方病与少数民族疾病教育部重点实验室，贵州 贵阳 550004；贵州医科大学 2附属医院；3附属白云医院)

血管性痴呆(VaD)被认为是出血性脑卒中、缺血性脑卒中和造成记忆、认知和行为等脑区低灌注的脑血管疾病所致的严重认知功能障碍综合征〔1〕。VaD发病机制目前尚不明确，研究〔2,3〕表明，炎症在VaD发病过程中起到关键作用，炎症相关因子直接参与VaD的发生发展。脑缺血缺氧可诱发急性或慢性炎症，而急、慢性炎症又可反过来加速继发性脑损伤进展，逐渐影响认知功能，最终导致VaD。炎症小体是一种多蛋白复合物，能够激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-1的表达，进而调节白细胞介素(IL)-1β、IL-18等促炎细胞因子的成熟和分泌。这些细胞因子在促进先天性免疫反应和炎症中起着关键作用。在各种炎症复合物中，含有NOD样受体NLR家族pyrin结构域(NLRP)3是最具特征的，NLRP3在包括创伤性脑损伤在内的各种脑疾病中起着至关重要的作用〔4,5〕。近年来有学者证实外源性的硫化氢(H2S)可抑制人肝细胞中NLRP3炎症小体的表达，从而减轻炎症反应〔6〕。同时也有学者证实〔7〕，H2S对脂多糖造成的炎症性急性肺损伤大鼠具有一定的保护作用。课题组前期的研究也证实给予大剂量(100 μmol/kg)的硫氢化钠(NaHS)预处理能够有效缓解大鼠神经元细胞缺血再灌注后的形态〔8〕。本文旨在探索H2S和NLRP3炎症小体在大鼠慢性低灌注损伤模型中所扮演的角色及可能的机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 SD大鼠50只，雄性，体重220～250 g，购自贵州医科大学动物实验中心〔合同号为：SCKY(黔)2018-0001〕。

1.2试剂 NaHS、二甲基对苯二胺盐酸盐、多聚甲醛、水合氯醛、三氯醋酸、三氯化铁、醋酸锌购于美国Sigma公司；NLRP3、Caspase-1抗体购自美国AdipoGEN公司，β-actin抗体购自美国Abcam公司，电化学发光(ECL)-Plus液购于美国Thermo Fisher Scientific公司，血清IL-1β、IL-18检测试剂盒购于北京百奥莱博科技有限公司，NLRP3抑制剂(CY-09)购自美国MedChemexpress(MCE)公司，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜购于美国Millipore公司，组织蛋白提取试剂盒购自碧云天生物公司。

1.3仪器 DMS2-Morris水迷宫购于中国医学科学院、ELX800UV酶标仪购于美国Bio-Tec公司、Varioskan LUX多通道酶标仪购于美国Thermo Fisher Scientific公司、GeneGnome XRQ化学发光成像仪购于英国SYNGENE公司、Western印迹跑胶装置电源北京百晶科技公司、离心机购于湖南湘仪有限公司、电热恒温水浴锅购于光明医疗仪器厂。

1.4实验动物筛选及分组 大鼠标准适应性喂养1 w后，进行Morris水迷宫空间探索实验和定向航行实验〔9～12〕，前4 d进行定向航行试验，方法为：每日按Ⅳ、Ⅲ、Ⅱ、Ⅰ象限顺序，将大鼠从各象限入水点面对池壁入水，记录1 min内大鼠从入水到爬上固定于第Ⅳ象限平台所需时间为逃避潜伏期。第5天进行空间探索实验，方法为：撤去平台，记录1 min内SD大鼠第1次穿过原站台的时间及穿过的总次数。最终选取了记忆力和学习能力相近的24只SD大鼠，随机分为4组，每组6只，分别为假手术组、模型组、抑制剂组(CY-09组)、NaHS组(NaHS 100 μmol/kg)。

1.5大鼠IRI模型制备 大鼠术前禁食12 h，禁水4 h，称重计算水合氯醛(350 mg/kg)的用量，成功麻醉后固定，备皮，75%乙醇和碘伏消毒，沿背侧颈正中切开，剥离皮下组织使双侧第一颈椎横突翼小孔暴露，使用直径0.5 mm 电凝针凝闭双侧椎动脉，局部伤口缝合前，涂抹适量青霉素粉防止感染，缝合皮肤。24 h 后行颈前正中切口，暴露双侧颈动脉，用微动脉夹夹闭双侧颈总动脉，夹闭3次，每次5 min，间隔1 h〔13〕。假手术组只分离颈总动脉和椎动脉，不进行颈总动脉夹闭和椎动脉凝闭。抑制剂组术前30 d开始腹腔注射5 mg/kg CY-09，造模成功后继续腹腔注射30 d，NaHS组术前30 d开始腹腔注射100 μmol/kg NaHS，造模成功后继续腹腔注射30 d。

1.6行为学实验 造模30 d后检测模型大鼠的学习记忆能力，进行Morris水迷宫空间探索实验和定向航行实验，方法同前。

1.7组织样本的制备 行为学实验结束后进行组织样本的制备。腹腔注射水合氯醛麻醉后，迅速取脑、取血。取大脑置于4%的多聚甲醛中浸泡24 h以上，备用。取2 ml股动脉血液于采血管中，迅速离心，分离出血清，-80℃冻存待检。

1.8苏木素-伊红(HE)染色 将大鼠脑组织切片进行HE染色，显微镜下观察海马神经元细胞。

1.9大鼠血清H2S浓度测定 用亚甲基蓝法〔14，15〕检测大鼠血清中的H2S的含量，预先在2.0 ml的EP管中加入15 μl的醋酸锌(1%)，然后加入大鼠血清100 μl，混匀，依次加入30 μl三氯醋酸(10%)、20 μl二甲基对苯胺盐酸盐(20 mmol/L)、20 μl三氯化铁(30 mmol/L)，用振荡器震荡10 s，置于37℃水浴箱中避光孵育10 min，6 000 r/min 离心10 min，取上清液180 μl检测吸光度值，根据H2S标准曲线计算出浓度〔Y=111.64X-2.429 8(R2=0.999 7)〕。

1.10大鼠血清IL-1β、IL-18含量测定 采用北京百奥莱博科技有限公司酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒进行。

1.11海马组织蛋白NLRP3、Caspase-1含量测定 采用Western印迹测定各组海马组织中NLRP3、Caspase-1表达量。

1.12统计学方法 采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析或非参数检验。

2 结 果

2.1行为学实验 与假手术组相比，模型组逃避潜伏期所需时间显著延长(P<0.05)，穿越平台次数显著减少(P<0.05)；与模型组比较，CY-09组和NaHS组逃避潜伏期显著缩短(P<0.05)，穿越平台次数显著增加(P<0.05)。见表1。

表1 各组定向航行实验、空间探索实验及血清H2S、IL-1β、IL-18含量及NLRP3、Caspase-1比较

2.2海马组织HE染色 在显微镜油镜下观察，假手术组大鼠海马区神经元细胞结构完整清晰，层次分明，排列紧密，层层叠加，细胞核染色较浅，胞质丰富，形态较完整。模型组海马区神经元细胞轮廓模糊，边界不清，神经元细胞层次明显减少，数量也明显减少，呈松散排列，细胞核发生固缩，染色深，有碎片出现。CY-09组大鼠海马较模型组明显轮廓清晰，神经元细胞数增多，细胞层次增多，细胞排列较紧密，仅尖部存在少量固缩细胞核。NaHS组大鼠海马较模型组明显轮廓清晰，排列较紧密，层次丰富，细胞数明显多于模型组，神经元细胞完整，胞质丰富，胞排列紧密，出现少量变形细胞。见图1。

图1 各组海马组织(HE染色，×100)

2.3血清H2S浓度水平比较 模型组血清H2S浓度低于假手术组、NaHS组及抑制剂组，差异均具有统计学意义(P<0.05)；CY-09组与假手术组相比无统计学差异，表明加入NLRP3小体抑制剂并没有使血清H2S浓度提升；NaHS组H2S浓度明显高于假手术组(P<0.05)。见表1。

2.4大鼠血清细胞因子变化情况 与模型组相比，CY-09组、NaHS组及假手术组血清IL-1β、IL-18浓度明显减低(P<0.05)。见表1。

2.5海马组织中NLRP3、Caspase-1蛋白的表达情况 模型组海马组织NLRP3、Caspase-1表达水平较假手术组明显升高(P<0.05)；经CY-09抑制剂处理的NLRP3蛋白水平明显低于模型组，同时Caspase-1表达也减低，差异均具有统计学意义(P<0.05)；NaHS组中NLRP3、Caspase-1表达水平较模型组也明显降低(P<0.05)。见表1、图2。

1～4:假手术组、模型组、CY-09组、NaHS组

3 讨 论

H2S是一种内源性气体信号分子，在生物体内发挥着广泛的生物学效应。近年来，研究证实H2S对缺血再灌注引发的组织器官具有很好的保护作用〔16,17〕。本课题组也探讨了H2S对VaD保护作用的部分机制，包括内质网应激〔18〕，线粒体自噬〔19〕，神经元细胞自噬〔13〕。本研究结果说明抑制NLRP3不会使H2S浓度升高，NLRP3小体介导的炎症反应参与了损伤的形成，但不是其唯一的发病因素，抑制NLRP3生成不能使血清中H2S浓度升高。

本研究提示NLRP3与大鼠缺血再灌注损伤正相关，抑制NLRP3生成可以减轻大鼠IRI，NLRP3参与IRI生理过程，IRI可以引起NLRP3表达增加，H2S能降低大鼠IRI过程中NLRP3的表达。

H2S对VaD的保护作用的机制十分复杂，涉及面广，炎症小体NLRP3在其中是如何发挥作用的，其具体的信号通路怎样，都有待进一步的探究。本研究仅进行了动物模型实验，并没有体外细胞实验的支撑，需要后续的更多研究来探讨NLRP3在H2S保护VaD中的作用。