润通莱蜜栓对慢传输型便秘小鼠的治疗作用

崔长升 刘莉 齐滨 李铁 赵晋莹 曹家桢 李丽 孙琦 王金凤 张昊旻

(长春中医药大学 1药学院，吉林 长春 130117；2针灸推拿学院；3吉林正容医药发展有限责任公司；4吉林敖东延边药业股份有限公司；5长春中医药大学康复医学院)

现代医学认为，慢传输型便秘(STC)临床主要表现为排便次数减少、便意减退甚则消失，且可伴有腹胀等症状〔1〕。在我国，STC发病率为4%～10%，且约1/3的老年人患有便秘，严重影响老年人的生活质量。中医认为便秘多由肠中有热，灼伤阴津所致。《兰室秘藏·大便结燥门》谓：“若饥饱失节，劳役过度，损伤胃气，及食辛热厚味之物，而助火邪，伏于血中，耗散真阴，津液亏少，故大便燥结”。中医通过辨证论治对STC的治疗具有独特的优势，取得了较好的临床疗效，患者接受度高〔2〕。

润通莱蜜栓是由蜂蜜、莱菔子、枳实、白术四味药组成的临床验方，其中蜂蜜补气温中、润燥通便，莱菔子健脾消食、行气导滞，枳实健脾行气、白术健脾益气，四者联用可起到行气润肠、通腑中郁滞的功效。但其治疗作用及机制尚不明确，不利于临床推广及新药开发，故本文旨在动物实验中探讨润通莱蜜栓对STC小鼠的治疗作用。

1 资料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 小白鼠(ICR，雄，体重18～22 g，SPF级)由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供；合格证编号：SCXK(吉)2016-0003。符合《动物实验管理条例》规定。

1.1.2实验材料 白术配方颗粒、莱菔子配方颗粒、枳实配方颗粒由广东一方制药有限公司提供。盐酸洛哌丁胺胶囊(批号：180726655)由西安杨森制药有限公司提供。枸橼酸莫沙必利片(批号：181003)由江苏豪森药业集团有限公司提供。苏木素-伊红(HE)染色试剂盒购自Solarbio，批号：20180704。山羊血清购自Solarbio，批号：20190408。一抗购自bioworld，批号：BS13278。c-kit抗体购自bioworld，批号：BS3621。二氨基联苯胺(DAB)试剂盒购自Solarbio，批号：20190416。

1.1.3实验仪器 RM2245型RM2245型轮转切片机，德国莱卡测量系统设备有限公司；EG1150H型自动包埋机，德国莱卡测量系统设备有限公司；HI1220型烘片机，德国莱卡测量系统设备有限公司；HI1210型铺片机，德国莱卡测量系统设备有限公司；DK-420S型三用恒温水浴槽，上海精宏实验设备有限公司；尼康SMZ25型体视显微镜，北京瑞科中仪科技有限公司。

1.2动物模型制备及分组给药 将小鼠平均分为空白对照组、模型对照组、阳性对照组、低、高剂量组。空白对照组采用蒸馏水灌胃，剩余组采用盐酸洛哌丁胺胶囊(1.5 mg/kg)经口灌胃，2次/d，连续灌胃21 d〔3〕。待造模成功后，空白、模型对照组，给予蒸馏水灌胃；阳性对照组采用枸橼酸莫沙必利片(2.5 mg/kg)经口灌胃；低、高剂量组分别给予0.05 ml/10 g、0.10 ml/10 g的润通莱蜜栓经口灌胃，2次/d，共7 d。

1.3观察指标

1.3.1活性炭推进率 经药物治疗7 d，禁食不禁水24 h。每组小鼠经炭末汁0.4 ml灌胃，灌胃完成立刻计时，30 min后将小鼠脱颈处死。幽门至所剪回盲处的距离计为肠管总长度，幽门至炭末汁前端处计为炭末推进长度〔4〕。

1.3.2观察小鼠结肠病理结构改变 剪取小鼠近肛门部位长约2 cm的结肠组织，采用生理盐水冲洗，置于10%中性甲醛溶液中固定，常规石蜡切片，厚度5 μm。HE染色后，显微观察结肠组织的结构〔5〕。

1.3.3观察小鼠结肠内酪氨酸肌酶受体(c-kit)蛋白表达量 剪取小鼠约2 cm的结肠组织，生理盐水冲洗干净后，置于10%中性甲醛溶液中固定，脱水，石蜡包埋，切5 μm薄片，脱蜡、抗原修复、阻断内源性过氧化物酶、血清封闭、加一抗、加二抗、DAB显色、复染细胞核、脱水封片、显微镜镜检。

1.4统计学方法 采用SPSS21.0软件进行方差分析。

2 结 果

2.1小鼠小肠炭末推进率结果 与空白组相比，模型组炭末推进率明显降低〔(56±4.90)%,P<0.01〕，盐酸洛哌丁胺已使小鼠肠道蠕动减慢，降低肠道传输功能，说明造模成功；与模型组相比较，阳性、低、高剂量组小鼠的炭末推进率均明显升高〔(85±7.08)%、(79±8.20)%、(82±7.78)%，P<0.01〕，阳性及润通莱蜜栓给药组对盐酸洛哌丁胺造成的小鼠便秘均具有治疗作用，且高剂量组炭末推进率接近阳性对照组。

2.2润通莱蜜栓对小鼠结肠形态结构的影响 小鼠结肠切片显示，模型对照组与空白对照组相比，结肠黏膜出现紊乱表征，肌层明显变薄，并伴有炎性细胞浸润现象；阳性对照组及低、高剂量组与模型组相比，小鼠结肠内黏膜排列趋向正常，且高剂量组肌层厚度最佳。见图1。

图1 小鼠结肠形态结构(HE)

2.3润通莱蜜栓对小鼠结肠内c-kit表达的影响 免疫组化法检测c-kit蛋白的表达如图2所示，c-kit阳性呈现棕黄色颗粒。模型组小鼠结肠肌层、结肠黏膜内棕黄色颗粒显著减少，说明c-kit蛋白表达较正常组显著降低；与模型组比较，阳性药组、低剂量组、高剂量组小鼠结肠内c-kit表达均有显著升高。

图2 小鼠结肠组织中c-kit表达(免疫组化法)

3 讨 论

中医在治疗STC中，获得了确切显著的临床疗效〔6〕。润通莱蜜栓是根据《伤寒论》蜜煎导方，结合多年临床实践而研制的，应用于各类便秘患者，尤其以慢性功能性便秘，取得了较好的临床疗效。方中蜂蜜具有补气温中、润燥通便，莱菔子可健脾消食、行气导滞、消食除胀、降逆化痰〔7〕，白术具有健脾益气、燥湿利水的功效〔8〕，枳实具有破气消极、化痰散癖等功效〔9〕，四者合用起到行气润肠，通腑郁滞的功效。

现代研究表明，白术含有挥发性成分、多糖类、内酯类、黄酮类、苷类等化学物质，具有抗肿瘤、抗炎镇痛、改善记忆力、调节脂代谢、降血糖、抗血小板、抑菌等多种药理作用〔10〕。枳实主要含有黄酮类、生物碱类、挥发油类等化学物质，具有调节肠胃运动、调节子宫功能、升压、强心、抗氧化、抗菌、镇痛、抗血栓等药理作用〔11〕。莱菔子含生物碱、硫代葡糖苷、异硫氰酸盐、黄酮、挥发油、脂肪油、蛋白质、多糖等化学物质，具有平喘、镇咳、祛痰、抗氧化、降血压、降血脂、抗菌、增强胃肠道动力、改善泌尿系统等多种药理作用〔12〕，三者与蜂蜜合用具有调节胃肠道疾病的特点。

目前，有学者认为便秘与Cajal细胞有密切的关系〔13～15〕。与c-kit是Cajal细胞(ICC)的特异性标志物〔16〕，胃肠道中平滑肌收缩运动与ICC数量有关，结肠组织ICC数量减少将导致结肠动力障碍〔17〕。ICC的发育、生存、形态异常或过度自噬均可导致胃肠节律性电活动异常，是导致胃肠动力下降的重要原因之一，c-kit可通过与干细胞因子(SCF)结合，激活SCF-c-kit信号通路，用来维持ICC发育、生长，因此c-kit可作为STC检测指标〔18～20〕。本研究说明润通莱蜜栓具有促进c-kit表达的作用，润通莱蜜栓与疗效存在量效关系，而且治疗效果比阳性药组更佳。

本试验结果证明润通莱蜜栓对STC小鼠有较好的治疗作用，为临床应用提供了参考依据。