miR-423-5p通过调控UCHL1表达对H2O2诱导的人晶状体上皮细胞损伤的影响

孙小叶 邓展峰 常早上

(邵阳学院 1护理学院，湖南 邵阳 422000；2附属第二医院五官科；3基础医学院)

白内障是严重影响人类生活的致盲性疾病，由于人口老龄化的加剧，其发病率明显升高〔1〕。白内障发病的原因较为复杂，研究显示，人晶状体上皮细胞的氧化应激和凋亡与白内障的发生发展密切相关〔2〕，减轻氧化应激引起的人晶状体上皮细胞凋亡对白内障的治疗有重要意义。miR-423-5p是一种微小RNA(miRNA)，在细胞增殖、凋亡、氧化应激等生命过程中发挥重要调控作用〔3〕。研究显示，干扰miR-423-5p表达可抑制过氧化氢(H2O2)诱导的心肌细胞凋亡，miR-423-5p有可能成为凋亡相关的心脏病治疗的新靶点〔4〕。但目前，miR-423-5p对人晶状体上皮细胞损伤的影响还未知。生物信息学软件预测显示，泛素羧基末端水解酶(UCH)L1的3′非编码区(3′UTR)含有与miR-423-5p互补的核苷酸序列，提示UCHL1可能是miR-423-5p的靶基因。UCHL1是一种泛素化酶，在神经元中大量表达。研究显示，UCHL1在年龄相关性白内障患者晶状体上皮细胞中的表达明显低于正常人，有一定的抗氧化保护作用〔5〕。本研究探讨miR-423-5p对H2O2诱导的人晶状体上皮细胞氧化应激和凋亡的影响及其是否通过调控UCHL1发挥作用。

1 材料与方法

1.1细胞和试剂 人晶状体上皮细胞细胞购自中国科学院上海细胞库；胎牛血清(FBS)购自浙江天杭生物科技有限公司；DMEM培养基、双荧光素酶活性检测试剂盒、Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒和BCA蛋白检测试剂盒均购自北京索莱宝；胰蛋白酶购自美国Sigma公司；LipofectamineTM2000试剂盒，美国Invitrogen公司；Trizol试剂、逆转录试剂盒和聚合酶链反应(PCR)试剂盒购自美国Fermentas公司；PCR引物购自上海生工生物工程有限公司；UCHL1、B淋巴细胞瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)多克隆抗体均购自美国Abcam公司；miR-144-3p mimics、miR-NC、anti-miR-144-3p、anti-miR-NC、pcDNA-UCHL1、pcDNA、si-UCHL1、si-NC均购自上海吉凯基因公司；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.2方法

1.2.1细胞培养和转染 用含10%FBS的DMEM培养基(常规培养基)培养人晶状体上皮细胞。将对数的人晶状体上皮细胞接种于6孔细胞培养板中(1×105个/孔)，培养24 h后，弃培养基。利用LipofectamineTM2000试剂盒，分别转染anti-miR-423-5p、anti-miR-NC、pcDNA-UCHL1、pcDNA、共转染anti-miR-423-5p与si-UCHL1、anti-miR-423-5p与si-NC。转染12 h后，更换新鲜培养基。再培养24 h后，RT-qPCR检测细胞中miR-423-5p或Western印迹检测UCHL1蛋白表达验证转染效果，并收集细胞用于后续实验。

1.2.2细胞分组 人晶状体上皮细胞分为对照组：细胞用常规培养基培养；H2O2组：细胞用含100 μmol/L H2O2的常规培养基培养12 h〔6〕。转染anti-miR-423-5p、anti-miR-NC、pcDNA-UCHL1、pcDNA、共转染anti-miR-423-5p与si-UCHL1、anti-miR-423-5p与si-NC的细胞均用含100 μmol/L H2O2的常规培养基培养12 h，并分别记为H2O2+anti-miR-423-5p组、H2O2+anti-miR-NC组、H2O2+pcDNA-UCHL1组、H2O2+pcDNA组、H2O2+anti-miR-423-5p+si-UCHL1组、H2O2+anti-miR-423-5p+si-NC组。每组设3个复孔。各组细胞培养结束后，检测各项指标，实验重复3次。

1.2.3RT-qPCR检测miR-423-5p和UCHL1 mRNA表达 用RNA提取试剂盒提取细胞中总RNA，经逆转录合成cDNA后，行PCR扩增。miR-423-5p上游5′-TGAGGGGCAGAGAGCGA-3′，下游5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6上游5′-GCTTCGGCAGCACATATA-3′，下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；UCHL1上游5′-CTATGAACTTGATGGACGAATGCC-3′，下游5′-GGACTTCTCCTTGCTCACGCTC-3′；GAPDH上游5′-CATCGAGCACGGCATCGTCA-3′，下游5′-TAGCACAGCCTGGATAGCAAC-3′。用 2-△△Ct法计算miR-423-5p相对U6、UCHL1 mRNA相对GAPDH的表达量。

1.2.4Western印迹检测蛋白表达 用RIPA试剂提取细胞中总蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度，行10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，并在室温环境中用5 %脱脂牛奶封闭1 h。然后于4℃冰箱中分别用UCHL1(稀释度1∶800)、Bax(稀释度1∶500)、Bcl-2(稀释度1∶500)和GAPDH一抗孵育过夜。洗膜后，在于37℃摇床中用辣根过氧化酶(HRP)标记的二抗IgG(稀释度1∶200)孵育1 h。加入显影液，避光显影，曝光拍照，Image J软件分析目的蛋白相对GAPDH表达量。

1.2.5酶联免疫吸附试验检测MDA、SOD和GSH-Px表达 向收集的各组细胞中加细胞裂解液，充分裂解细胞，3 500 r/min离心10 min，取上清。分别利用MDA、SOD和GSH-Px试剂盒，检测上清中MDA含量及SOD和GSH-Px活性。

1.2.6流式细胞仪检测细胞凋亡 用适量磷酸盐缓冲液(PBS)将收集的细胞清洗2次，1 500 r/min离心5 min后，弃PBS，加500 μl结合缓冲液，重悬细胞。加10 μl Annexin V-FITC，室温避光孵育10 min。再加5 μl PI，室温避光孵育5 min后，上流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.7双荧光素酶报告基因实验验证miR-423-5p与UCHL1靶向关系 将对数期人晶状体上皮细胞接种于6孔细胞培养板中(1×105个/孔)，培养24 h后，弃培养基。利用LipofectamineTM2000试剂盒，分别共转染WT-UCHL1与miR-423-5p mimics、WT-UCHL1与miR-NC、MUT-UCHL1与miR-423-5p mimics、MUT-UCHL1与miR-NC。转染12 h后，更换新鲜培养基。再培养24 h后，加细胞裂解液，充分裂解细胞。3 500 r/min离心10 min，取上清液，利用双荧光素酶活性检测试剂盒，检测荧光素酶活性，结果以萤火虫与海肾的荧光强度比值表示。

1.3统计学方法 利用SPSS22.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1miR-423-5p及UCHL1在H2O2诱导的人晶状体上皮细胞损中的表达 与对照组相比，H2O2组miR-423-5p表达显著升高，UCHL1 mRNA 和蛋白表达显著降低(均P<0.05)。见图1、表1。

图1 H2O2诱导的人晶状体上皮细胞中UCHL1蛋白表达

表1 miR-423-5p及UCHLl在H2O2诱导的人晶状体上皮细胞中的表达

2.2干扰miR-423-5p对H2O2诱导的人晶状体上皮细胞氧化应激的影响 H2O2+anti-miR-423-5p组miR-423-5p表达水平(0.23±0.04)显著低于H2O2+anti-miR-NC组(1.00±0.08，t=25.827，P<0.05)，表明anti-miR-423-5p转染成功，人晶状体上皮细胞中miR-423-5p表达受到干扰。与对照组相比，H2O2组MDA水平显著升高，SOD和GSH-Px活性均显著降低(均P<0.05)。与H2O2+anti-miR-NC组比较，H2O2+anti-miR-423-5p组MDA水平显著降低，SOD和GSH-Px活性均显著上升(均P<0.05)。见表2。

表2 干扰miR-423-5p对H2O2诱导的人晶状体上皮细胞氧化应激的影响

2.3干扰miR-423-5p对H2O2诱导的人晶状体上皮细胞凋亡的影响 与对照组相比，H2O2组细胞凋亡率和Bax蛋白显著升高，而Bcl-2蛋白显著降低(均P<0.05)。与H2O2+anti-miR-NC组比较，H2O2+anti-miR-423-5p组细胞凋亡率和Bax蛋白显著降低，而Bcl-2蛋白显著升高(均P<0.05)。见图2、表3、图3。

图3 H2O2诱导的干扰miR-423-5p的人晶状体上皮细胞凋亡流式图

表3 干扰miR-423-5p对H2O2诱导的人晶状体上皮细胞凋亡的影响

1～4：对照组,H2O2组,H2O2+anti-miR-NC组,H2O2+anti-miR-423-5p组

2.4UCHLl过表达对H2O2诱导的人晶状体上皮细胞的影响 H2O2+pcDNA-UCHL1组UCHL1蛋白表达水平显著高于H2O2+pcDNA组(P<0.05)，表明pcDNA-UCHL1转染成功，人晶状体上皮细胞中UCHL1过表达。与H2O2+pcDNA组比较，H2O2+pcDNA-UCHL1组MDA水平、细胞凋亡率、Bax蛋白均显著降低，而SOD和GSH-Px活性、Bcl-2蛋白均显著升高(均P<0.05)。见图4，表4。

1～4：对照组,H2O2组,H2O2+pcDNA组,H2O2+pcDNA-UCHL1组

表4 UCHLl过表达对H2O2诱导的人晶状体上皮细胞的影响

2.5miR-423-5p靶向调控UCHL1的表达 生物信息学软件预测显示的UCHL1的3′UTR与miR-423-5p互补的结合位点见图5。共转染miR-423-5p与WT-UCHL1的人晶状体上皮细胞荧光素酶活性显著低于共转染miR-NC与WT-UCHL1的细胞(P<0.05)，说明miR-423-5p可与UCHL1靶向结合。见表5。转染miR-423-5p mimics的人晶状体上皮细胞中UCHL1蛋白表达量(0.24±0.03)显著低于转染miR-NC的细胞(0.58±0.05，t=17.493，P<0.05)，转染anti-miR-423-5p的人晶状体上皮细胞中UCHL1蛋白表达量(0.97±0.08)显著高于转染anti-miR-NC的细胞(0.55±0.05，t=13.356，P<0.05)，进一步说明miR-423-5p负调控UCHL1表达，见图6。

1～4：miR-NC组，miR-423-5p组，anti-miR-NC组，anti-miR-423-5p组

表5 荧光素酶活性检测

图5 UCHL1的3′UTR中含有与miR-423-5p互补的核苷酸序列

2.6干扰UCHL1逆转干扰miR-423-5p对H2O2诱导的人晶状体上皮细胞损伤的作用 与H2O2+anti-miR-423-5p+si-NC组比较，H2O2+anti-miR-423-5p+si-UCHL1组UCHL1蛋白、SOD及GSH-Px活性、Bcl-2蛋白显著降低，而MDA水平、细胞凋亡率及Bax蛋白显著升高(均P<0.05)。见表6，图7。

表6 干扰UCHL1逆转干扰miR-423-5p对H2O2诱导的人晶状体上皮细胞损伤的作用

1～4:H2O2组+anti-miR-NC组，H2O2组+anti-miR-423-5p组，H2O2组+anti-miR-423-5p+si-NC组，H2O2组+anti-miR-423-5p+si-UCHL1组

3 讨 论

晶状体上皮细胞的氧化损伤在白内障的发病过程中发挥重要作用。氧化应激发生时，机体内的活性氧在晶状体上皮细胞内过量聚集，氧化代谢物的增加会对细胞产生毒性作用，损伤细胞结构和功能，引起细胞凋亡〔7〕。MDA是脂质过氧化产物之一，其含量高低可反映氧化应激水平〔8〕。生理状态下，体内的抗自由基损伤酶如SOD和GSH-Px，可清除多余的活性氧，使自由基的产生和清除处于动态平衡〔9〕。晶状体上皮细胞的凋亡是白内障形成的始动环节和病理基础〔10〕。促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2参与调控细胞凋亡，Bax表达升高会促进细胞凋亡，而Bcl-2表达升高则会抑制细胞凋亡。H2O2常被用于诱导晶状体上皮细胞建立损伤模型。本研究结果显示，H2O2诱导后，晶状体上皮细胞MDA表达水平、细胞凋亡率及Bax蛋白表达升高，SOD和GSH-Px水平及Bcl-2蛋白表达降低，与相关研究结果一致〔11,12〕，说明H2O2刺激细胞产生了氧化应激、细胞受损、凋亡加剧。

miRNA在真核生物中广泛存在，参与调控人晶状体上皮细胞损伤。Li等〔13〕研究显示，miR-34a在H2O2诱导的人晶状体上皮细胞中表达升高，其通过下调Bcl-2和沉默信息转录调控因子(SIRT)1表达促进人晶状体上皮细胞凋亡。研究显示，心肌损伤、糖尿病、肿瘤等疾病中miR-423-5p均异常表达〔14～16〕，miR-423-5p是多种疾病的潜在治疗靶点。目前，miR-423-5p对人晶状体上皮细胞损伤的影响还未知。本研究结果提示miR-423-5p可能参与白内障的发生、发展；干扰miR-423-5p表达可抑制H2O2诱导的人晶状体上皮细胞氧化应激，保护细胞免受H2O2诱导的氧化损伤。同时干扰miR-423-5p还减少了H2O2诱导的人晶状体上皮细胞凋亡及Bax蛋白表达，并增加了细胞中Bcl-2蛋白表达，说明干扰miR-423-5p表达可抑制H2O2诱导的人晶状体上皮细胞凋亡。提示miR-423-5p促进H2O2诱导的晶状体上皮细胞氧化应激和凋亡，其可能是白内障治疗的潜在作用靶点。

UCHL1属于去泛素化酶家族成员，在神经系统分布广泛。多种病理条件下，UCHL1表达缺失。黄婷等〔17〕研究显示UCHL1在缺血缺氧脑损伤大鼠海马组织中表达降低，其对损伤的海马神经细胞的修复有重要作用。胡雅岑等〔18〕研究显示，帕金森病模型小鼠黑质脑组织中UCHL1表达降低，UCHL1参与帕金森病的发生、发展。本研究结果提示miR-423-5p通过靶向抑制UCHL1表达促进H2O2诱导的人晶状体上皮细胞氧化应激的凋亡。

综上，H2O2能够引起人晶状体上皮细胞氧化应激损伤和细胞凋亡，而干扰miR-423-5p表达对H2O2诱导的人晶状体上皮细胞氧化应激和凋亡发挥抑制作用，这可能与miR-423-5p靶向负调控UCHL1表达有关。