舒芬太尼通过AWPPH对宫颈癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响

周辉 张国艳 肖开提·乃斯如拉

(新疆喀什地区第二人民医院麻醉科，新疆 喀什 844000)

宫颈癌是威胁女性生命安全的恶性肿瘤之一，其具有较高的发病率且患病人群趋于年轻化，而宫颈癌侵袭、转移及复发是导致患者治疗失败的重要原因〔1,2〕。肿瘤细胞增殖与凋亡等生物学特性也可参与肿瘤生长及转移过程〔3〕。因而针对肿瘤侵袭及转移寻找宫颈癌治疗药物有助于提高治疗效果。阿片类药物可影响肿瘤细胞增殖、凋亡等生物学过程，还可能影响患者预后〔4〕。研究表明舒芬太尼作为一种阿片类镇痛药物可影响肝癌细胞增殖及凋亡〔5〕。相关报道指出长链非编码RNA(LncRNA)AWPPH在膀胱癌、乳腺癌、肝癌中表达上调，并可促进细胞的恶性增殖及迁移侵袭〔6～8〕。本研究观察了不同浓度的舒芬太尼处理SiHa细胞后对细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响，并初步探讨其对AWPPH的调控作用机制。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 舒芬太尼购自人福医药集团股份公司(批号：1180620)。宫颈癌SiHa细胞购自美国ATCC细胞库。AWPPH小干扰RNA(si-AWPPH)、乱序无意义阴性对照序列(si-NC)、AWPPH过表达载体(pcDNA3.1-AWPPH)及阴性对照(pcDNA3.1)购自广州锐博生物科技有限公司；反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司；噻唑蓝(MTT)、细胞凋亡试剂盒购自日本同仁研究所；Transwell小室、基质胶购自美国BD公司；兔抗人细胞周期蛋白(Cyclin)D1、B淋巴细胞瘤(Bcl)-2、基质金属蛋白酶(MMP)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)抗体均购自美国Santa Cruz公司；山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G二抗购自美国AAT Bioquest公司。

1.2实验处理与分组 宫颈癌SiHa细胞用DMEM培养基常规培养，选取对数生长期SiHa细胞，用不同浓度(0.01 μg/ml、0.02 μg/ml、0.04 μg/ml)的舒芬太尼处理细胞〔9〕。实验分组：con组(正常培养的SiHa细胞)、舒芬太尼0.01 μg/ml组(0.01 μg/ml的舒芬太尼处理细胞24 h)、舒芬太尼0.02 μg/ml组(0.02 μg/ml的舒芬太尼处理细胞24 h)、舒芬太尼0.04 μg/ml组(0.04 μg/ml的舒芬太尼处理细胞24 h)。后续实验为验证舒芬太尼是否可通过调控AWPPH的表达而发挥作用，实验分组：舒芬太尼0.04+pcDNA3.1组(pcDNA3.1转染至SiHa细胞48 h，0.04 μg/ml的舒芬太尼处理细胞24 h)、舒芬太尼0.04+pcDNA3.1-AWPPH组(pcDNA3.1-AWPPH转染至SiHa细胞48 h，0.04 μg/ml的舒芬太尼处理细胞24 h)。

1.3qRT-PCR检测细胞中AWPPH的表达水平 提取各组SiHa细胞总RNA，合成cDNA后进行qRT-PCR，采用2-ΔΔCt法计算AWPPH相对表达量。

1.4MTT检测细胞增殖 各组SiHa细胞分别于作用24 h、48 h、72 h后，按试剂盒说明加入MTT溶液，最后用酶标仪检测490 nm处吸光度值(OD)，计算细胞增殖抑制率(%)=(空白组-实验组)/空白组×100%。

1.5流式细胞术检测细胞凋亡 收集各组SiHa细胞，按照试剂盒说明书操作，最后上流式细胞仪检测。

1.6Transwell实验检测细胞迁移与侵袭 迁移：上室加入200 μl单细胞悬液(5×104个/孔)，下室加入含血清培养液，培养24 h，多聚甲醛固定后用0.1%结晶紫染液染色，显微镜下观察迁移细胞数。侵袭：用基质胶包被Transwell小室上室，其余步骤同迁移实验。

1.7Western印迹检测CyclinD1、Bcl-2、MMP-2、Bax、E-cadherin蛋白表达 提取各组SiHa细胞总蛋白，变性后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)以分离蛋白，转膜、封闭，加入CyclinD1(1∶1 000)、Bcl-2(1∶500)、MMP-2(1∶800)、Bax(1∶500)、E-cadherin(1∶500)一抗稀释液，4℃孵育24 h，加入二抗稀释液(1∶5 000)室温孵育1 h，显影，分析各条带灰度值。

1.8统计学处理 采用SPSS21.0软件进行独立样本t检验、单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1舒芬太尼对SiHa细胞增殖、凋亡的影响 用不同浓度的舒芬太尼处理宫颈癌SiHa细胞，结果显示，与con组相比，舒芬太尼0.01 μg/ml组、舒芬太尼0.02 μg/ml组、舒芬太尼0.04 μg/ml组SiHa细胞增殖抑制率和凋亡率升高，CyclinD1、Bcl-2相对表达量降低，而Bax相对表达量升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，其中舒芬太尼0.04 μg/ml作用效果较为显著，见图1、表1、图2。

图1 舒芬太尼处理后SiHa细胞凋亡

表1 舒芬太尼对SiHa细胞增殖、凋亡的影响

1～4:con组、舒芬太尼0.01 μg/ml组、舒芬太尼0.02 μg/ml组、舒芬太尼0.04 μg/ml组；图4同

2.2舒芬太尼对SiHa细胞迁移、侵袭的影响 与con组相比，舒芬太尼0.01 μg/ml组、舒芬太尼0.02 μg/ml组、舒芬太尼0.04 μg/ml组SiHa细胞迁移与侵袭数目减少，MMP-2相对表达量降低，E-cadherin相对表达量升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图3、表2、图4。

图3 舒芬太尼对SiHa细胞迁移、侵袭的影响(结晶紫染色，×200)

图4 舒芬太尼对SiHa细胞迁移、侵袭蛋白表达的影响

2.3舒芬太尼对SiHa细胞中AWPPH表达的影响 与con组相比，舒芬太尼0.01 μg/ml组、舒芬太尼0.02 μg/ml组、舒芬太尼0.04 μg/ml组SiHa细胞中AWPPH mRNA表达水平显著降低(P<0.05)，见表2。

表2 舒芬太尼对SiHa细胞迁移、侵袭及AWPPH表达的影响

2.4抑制AWPPH对SiHa细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响 与si-NC组相比，si-AWPPH组SiHa细胞增殖抑制率和凋亡率明显升高，迁移和侵袭细胞数明显减少，CyclinD1、Bcl-2、MMP-2相对表达水平明显降低(P<0.05)，Bax、E-cadherin相对表达水平明显升高(P<0.05)，见图5、表3、表4、图6。

图6 抑制AWPPH对SiHa细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭蛋白表达的影响

表3 抑制AWPPH对SiHa细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响

表4 抑制AWPPH对SiHa细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭蛋白表达的影响

图5 抑制AWPPH对SiHa细胞凋亡的影响

2.5过表达AWPPH能逆转舒芬太尼对SiHa细胞增殖、凋亡的作用 与舒芬太尼0.04+pcDNA3.1组相比，舒芬太尼0.04+pcDNA3.1-AWPPH组SiHa细胞增殖抑制率和凋亡率明显降低，CyclinD1、Bcl-2相对表达量明显升高，Bax相对表达量明显降低(P<0.05)，见图7、表5、表6、图8。

图7 过表达AWPPH能逆转舒芬太尼对SiHa细胞凋亡的影响

1～4：con组，舒芬太尼0.04 μg/ml组，舒芬太尼0.04+pcDNA3.1组，舒芬太尼0.04+pcDNA3.1-AWPPH组；图9同

表5 过表达AWPPH能逆转舒芬太尼对SiHa细胞增殖、凋亡的影响

表6 过表达AWPPH能逆转舒芬太尼对SiHa细胞增殖、凋亡蛋白表达及迁移、侵袭的影响

2.6过表达AWPPH能逆转舒芬太尼对SiHa细胞迁移、侵袭的作用 与舒芬太尼0.04+pcDNA3.1组相比，舒芬太尼0.04+pcDNA3.1-AWPPH组SiHa细胞迁移与侵袭数明显增多，MMP-2相对表达量明显升高，E-cadherin相对表达量明显降低(P<0.05)，见表6、图9。

图9 过表达AWPPH能逆转舒芬太尼对SiHa细胞迁移、侵袭蛋白表达的影响

3 讨 论

舒芬太尼是一种新型的阿片类镇痛药，作用于μ阿片受体，研究表明舒芬太尼可抑制胃癌细胞增殖并诱导细胞凋亡〔10〕。舒芬太尼还可通过调控细胞凋亡相关蛋白表达从而诱导大鼠肝癌瘤细胞凋亡〔11〕。相关报道指出舒芬太尼可有效缓解宫颈癌患者术后的应激反应〔12〕。本研究结果显示，舒芬太尼可抑制宫颈癌细胞增殖。研究表明CyclinD1在宫颈癌中呈高表达，并可促进细胞周期进程，促进细胞增殖〔13〕。Bcl-2可抑制细胞凋亡，Bax在肿瘤中呈高表达并可促进细胞凋亡〔14〕。本研究结果提示舒芬太尼可诱导宫颈癌细胞凋亡。MMP-2可降解细胞外基质及基底膜从而促进肿瘤细胞迁移及侵袭，上皮细胞间质转化(EMT)可增强肿瘤细胞侵袭能力，其中上皮标志物E-cadherin表达下调可促进EMT〔15〕。本研究结果说明舒芬太尼抑制宫颈癌细胞黏附力作用机制与E-cadherin、MMP-2蛋白有关。

AWPPH在结肠癌细胞中呈高表达，下调AWPPH的表达可通过下调葡萄糖轻运蛋白(GLUT)-1的表达而抑制结肠癌细胞增殖〔16〕。AWPPH通过调控miR-93-3p/FZD7分子轴及激活Wnt/β-catenin途径而促进骨肉瘤进展〔17〕。研究表明AWPPH表达水平升高可促使非小细胞肺癌患者术后复发〔18〕。本研究结果显示不同浓度的舒芬太尼处理后宫颈癌细胞中AWPPH的表达水平显著降低，进一步抑制AWPPH表达后可减弱宫颈癌细胞增殖、迁移及侵袭能力，促进细胞凋亡。为验证舒芬太尼是否可通过调控AWPPH的表达而抑制宫颈癌细胞的恶性生物学行为，本研究将AWPPH过表达载体转染入宫颈癌细胞，随后使用舒芬太尼处理，结果显示，宫颈癌细胞增殖抑制率和凋亡率降低，而迁移与侵袭细胞数增多，提示舒芬太尼可能通过下调AWPPH影响宫颈癌细胞的恶性生物学行为。

综上所述，舒芬太尼可抑制宫颈癌细胞增殖、迁移及侵袭能力，并可促进细胞凋亡，其作用机制与抑制AWPPH的表达有关，为进一步研究舒芬太尼对宫颈癌细胞的作用机制奠定理论基础，可为治疗宫颈癌提供新方向。