东魁杨梅种仁油提取工艺及抗氧化活性研究

陈俊宇，孔伟华，黄 怡，吴成茹，崔 琦，刘巨钊

(浙江中医药大学药学院1，杭州 311402)(浙江中医药大学基础医学院2，杭州 310053)(浙江中医药大学生命科学学院3，杭州 310053)

杨梅(Myricarubra)是杨梅科杨梅属植物，分布于我国南部各省，生于低山丘陵向阳山坡或山谷中，至今已有上千年的栽培历史[1,2]。作为重要的药食同源植物，杨梅的根、树皮、果实均可入药，其药用价值最早记载于唐代孟诜编纂的《食疗本草》中，《本草纲目》中记载其果实可入药，其味甘酸，性温，可用于治疗扁桃体炎、牙龈红肿等疾病[3,4]。我国是全世界最大的杨梅产区，浙江省仙居市的杨梅品质最佳[5]。杨梅除了作为水果以外，还在饮料、罐头等食品加工行业占有一席之地，杨梅种仁富含植物油脂、蛋白质、维生素等营养成分[6,7]。目前国内外对杨梅种仁油的研究尚处起步阶段，尤其是对东魁杨梅种仁的相关研究尚且较少。油脂是人类日常摄入的物质之一，具有抗氧化功能。相比于过多摄入会引发胆固醇与血糖迅速上升的饱和脂肪酸，不饱和脂肪酸的适量摄入更具优势，如阻碍脂肪团、改善血脂以及血糖的整体水平、防控突然发生心血管病的隐患，还有助于促进糖尿病的迅速康复[8,9]。

中药提取是影响因素复杂的非线性过程。响应面法(RSM)是提取工艺优化的传统方法，但存在无法反映多因素多水平的非线性复杂关系的局限性，且依赖于大量的验证实验[10]。人工神经网络(ANN)基于其输入层、隐藏层、输出层的3层神经网络结构，可通过相应函数完成输入层与输出层的高度非线性拟合，从而实现对多因素多指标的实验优化，因此在提取工艺的优化中具有更大的优势[11]。目前ANN已经在提取工艺优化中得到了一定的应用，如生物碱、皂苷、黄酮等活性成分的提取工艺优化[12]。ANN在油脂的高效提取中应用效果较好，如应用超临界CO2流体提取枸杞籽中棕榈酸、亚油酸等物质，经过ANN的工艺优化，提取率14.28%，可达原料含脂量的91%[13]。本实验研究了东魁杨梅的种仁油的提取工艺及抗氧化活性，以期提高杨梅资源利用率，寻找并开发油料植物的替代资源，为油脂资源开发提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料

东魁杨梅(Myricarubracv.Dongkui, MRDK)于2021-06采自浙江省台州市横溪镇(120.470 6 °E, 28.735 2 °N)，并由浙江中医药大学张春椿副教授鉴定。提取所用试剂为分析纯，检测所用试剂为色谱纯。

1.2 提取及工艺优化

1.2.1 索氏提取

称量5.0 g粉碎后的东魁杨梅种仁，放入索氏提取器中，并加入100 mL石油醚(60～90 ℃)，在80 ℃下水浴中提取6 h。经毛细管法检测无油脂后，完成提取，并经减压浓缩后得到东魁杨梅种仁油(MRDK kernel oil, MRDKKO)，置于4 ℃冰箱中备用。

1.2.2 超声有机溶剂提取

准确称量5.0 g粉碎后的东魁杨梅种仁，置于锥形瓶中，并加入石油醚(60～90 ℃)，在超声辅助提取仪中进行提取，在提取过程中分别对液固比、提取时间、提取温度、超声功率进行单因素考察，再利用人工神经网络对提取工艺进行进一步优化。提取结束后，进行抽滤，并经减压浓缩后得到东魁杨梅种仁油，置于4 ℃冰箱中备用。

1.3 脂肪酸成分分析

1.3.1 脂肪酸转酯化

准确称量5.0 g的MRDKKO于圆底烧瓶中，依次加入45 mL甲醇和5 mL的H2SO4甲醇溶液(0.1 mol/L)，放入转子后连接好反应装置，于300 r/min转速下，在80 ℃水浴中，进行脂肪酸转酯化，反应时间为2 h。反应结束后将冷却至室温的烧瓶中溶液全部转移至分液漏斗中后，加入适量去离子水，静置4 h。上层即为脂肪酸甲酯，加入适量无水Na2SO4后，按1∶1 000加入色谱正己烷，以14 000 r/min离心后置于4 ℃冰箱中备用。

1.3.2 GC/Q-TOF MS检测

安捷伦7890B-7250四级杆飞行时间质谱仪(GC/Q-TOF MS)。色谱条件：色谱柱：HP-5MS(30 m×250 μm×0.25 μm)；进样口温度250 ℃；升温程序为：初始温度50 ℃，以60 ℃/min升温至170 ℃，保持1 min，再以5 ℃/min升温至180 ℃，保持5 min，最后以20 ℃/min升温至220 ℃，保持5 min；载气为高纯氦气(99.999 9%)，流速1.2 mL/min；进样量1 μL；不分流。质谱条件：电子轰击电离(EI)模式，电离能源70 eV，离子源温度200 ℃，传输线温度290 ℃，数据采集方式为TOF-Scan全扫描；质量扫描范围m/z50～500；采集速率5 spectra/s；溶剂延迟5 min。通过NIST14标准谱数据库并结合文献资料完成结构鉴定。

1.4 理化性质测定

相对密度：GB/T 5518—2008，折射系数：GB/T 5527—2010，酸值：GB/T 5530—2005，碘值：GB/T 5532—2008，过氧化值：GB/T 5538—2005。

1.5 SEM分析

将提取前后的东魁杨梅种仁置于真空干燥箱中烘干至恒重，制样后，经喷金处理，于SU8010场发射扫描电子显微镜下进行观察分析。

1.6 DPPH自由基清除活性

分别将0.1 mL一系列浓度的东魁杨梅种仁油与1.4 mL 95%乙醇及1 mL 40 μg/mL的DPPH乙醇溶液进行混合，避光放置70 min后于517 nm波长下测定其吸光度，空白样品以95%乙醇替代样品溶液，实验重复3次，且VC为对照。

1.7 统计分析

所有实验均重复3次，使用MS Excel完成统计分析，用Origin 8.0软件作图，使用MATLAB完成人工神经网络代码编写及相关优化。

2 结果与分析

2.1 油脂成分

索氏提取法对MRDKKO的得率为62.00%。转酯化后通过GC/Q-TOF MS结果可以看出(图1)，共有5个主要的信号峰，其中含量最高的2个信号峰分别是亚油酸和油酸，总不饱和脂肪酸质量分数高达82.20%，其种类及对应关系如表1所示。

注：图中编号与表1对应一致。

与荸荠杨梅种仁油相比(表2)，MRDKKO酸值、过氧化值均较低，结合表1不难发现，这是由于MRDKKO中游离脂肪酸更少、不饱和脂肪酸含量更高造成的。与传统食用油大豆油和橄榄油相比，MRDKKO酸值及过氧化值显著低于大豆油和橄榄油[14,15]，碘值则介于大豆油与橄榄油之间，表明MRDKKO已达到食用油的标准，可作为天然食用油进行开发。

表1 东魁杨梅种仁油的脂肪酸成分

表2 东魁杨梅种仁油主要理化性质

2.2 单因素及人工神经网络实验

2.2.1 单因素实验

在图2中，MRDKKO的提取率随液固比的增加而显著增加，而当液固比达到14 mL/g时，MRDKKO的提取率基本不再增加，这是因为液固比为12 mL/g时提取率已基本达到最大值，使用过多的提取溶剂则会增加成本，同时有机溶剂也会在提取过程中挥发，因此，选择液固比为12 mL/g进行MRDKKO的提取。

图2 东魁杨梅种仁油单因素实验提取结果

随着提取时间的延长，MRDKKO的提取率得以增加，且在提取时间为40 min基本达到最大值，尽管持续增加提取时间MRDKKO的提取率有一定程度的增加，然而综合考虑提取率与提取时间的效率问题，选取提取时间为40 min进行后续实验。

提取温度从20 ℃增加到40 ℃时MRDKKO提取率显著提高，这是因为温度的上升会加速对细胞的破坏和油脂的溶出，而过高的温度则会导致有机溶剂的挥发，影响提取的传质效率，从而降低提取率，因此，40 ℃作为适宜的提取温度进行实验。

超声功率从100 W增加至300 W，MRDKKO的提取率呈现不断增加的趋势，当超声功率超过300 W时，提取率则不再增加，这是因为超声功率的提高会加速其对细胞的破坏，但当超声功率持续增加会使温度升高，一方面导致溶剂挥发，另一方面减少了溶剂与东魁杨梅种仁的接触，最终导致提取率的下降，故300 W作为最佳的超声功率。

2.2.2 人工神经网络实验

从单因素实验结果可以分析出，液固比、提取时间、提取温度这3个因素对MRDKKO的提取效果影响显著，故利用ANN对这3个因素进行优化分析。在ANN优化过程中，以3个因素为输入层，MRDKKO提取率为输出层，构建了3-8-1的ANN模型，其中设置60%的数据为训练集，20%的数据为验证集，20%的数据为测试集，通过对MRDKKO提取率的ANN预测分析发现(图3)，训练集、测试集、矫正集及整个模型的R值分别为0.999 21、0.999 8、0.999 93和0.994 67，非常接近1，且所有数据都分布在40o线左右，表明建立的ANN模型与实验数据的完美拟合，也进一步证明了实验值与ANN预测值间具有良好的相关性。结合ANN模型拟合并通过软件分析得出最佳工艺参数：液固比13.91 mL/g，提取时间40.85 min，提取温度42.66 ℃，MRDKKO提取率为67.94%，在实际实验操作中，选取液固比14 mL/g，提取时间41 min，提取温度42 ℃进行验证实验，重复3次后MRDKKO提取率为67.87%，可以发现，模拟拟合可靠合理，结果预测准确。

图3 实验数据与每一步计算的神经网络数据的散点比较图

2.2.3 提取动力学

采用一级动力学模型对超声有机溶剂提取MRDKKO随提取时间变化进行研究，得到如图4所示的动力学曲线，并经软件拟合得到动力学参数即提取达到平衡时的提取率C∞为68.93，提取反应速率常数k为0.12，R2=0.98，数据表明采用一级动力学方程对MRDKKO的提取是适合的，同时结合C∞与k结果发现使用超声有机溶剂提取东魁杨梅种仁在41 min左右基本达到提取平衡及最大提取率，表明超声有机溶剂提取法提取效率较高。

图4 超声有机溶剂法提取东魁杨梅种仁油动力学曲线

2.3 SEM

扫描电镜结果能够衡量出提取方法对样品表面的破坏程度，通常植物油脂存在于细胞内或细胞间，对样品表面破坏的越严重，说明更有利于油脂渗透到提取溶剂中。由图5可以看出未提取的样品表面光滑，组织没有被破坏，且有较多的油脂存在；由于索氏提取时间长，组织有一定程度的破坏，且油脂有所减少；超声有机溶剂提取由于超声空化力与有机溶剂的共同作用，对组织破坏的最严重，可以发现基本无油脂的存在。

图5 不同方法提取油脂后东魁杨梅种仁SEM图

2.4 DPPH自由基清除能力

如图6所示，随着MRDKKO浓度的增加，其DPPH自由基清除能力增加，当MRDKKO质量浓度增加至9.95 mg/mL时达到DPPH自由基的半数清除活性浓度即IC50值，与对照VC的IC50值0.067 mg/mL相比，虽然其DPPH自由基清除能力显著低于VC，但MRDKKO为油脂类，无法直接比拟VC这种强还原剂，与其他种类的植物油脂相比，MRDKKO由于富含不饱和脂肪酸，故其作为植物天然油脂DPPH自由基清除活性较好。

图6 东魁杨梅种仁油DPPH自由基清除能力

3 讨论

本研究使用超声有机溶剂法对东魁杨梅种仁油进行提取，分别对液固比、超声时间、提取温度、超声功率4个因素进行单因素进行优化。发现液固比、提取时间、提取温度是对东魁杨梅种仁油提取率影响较大的3个因素。超声功率影响较小的原因是由于杨梅种仁本身质地较软，粉碎后能够充分与溶剂接触，较低的超声功率即可达到较好的提取效果，所以低功率和高功率超声对油脂的提取率影响较小。通常在工业化生产中，不会使用超声有机溶剂提取法进行大规模提取，这也为工业化使用其他方法对东魁杨梅种仁油的高效提取提供支持[16]。人工神经网络法近年来在提取工艺优化等领域有广泛应用，因其算法简单，预测结果准确，对训练集数据要求低等优势明显优于传统的RSM法正得到越来越多的关注[17]。工艺优化是绿色化学的核心思想之一，尽量使用最少的提取溶剂、相对最短的提取时间、更低的温度获取到更高的得率，是工业生产中尤为重要的一环[18]。尤其是目前杨梅油产品还处于发展的萌芽阶段，市面上相关产品甚少，现如今正是抢占市场的良好时间。结合前期实验发现这可能与杨梅种子壁厚，难剥离造成的，种子难处理极大地限制了杨梅油产业的发展[19]。杨梅在我国南部各省山区分布广泛，是一种重要的经济作物，资源储量充足。只有建立在绿色化学的基础上，解决杨梅种子难剥离的问题，才能够实现将杨梅种仁油开发为高品质食用油。

4 结论

本研究使用GC/Q-TOF MS气质联用仪建立一套快速、准确的针对东魁杨梅种仁油进行成分分析及结构鉴定的检测方法。结果表明东魁杨梅种仁油中亚油酸质量分数可达38.72%，总不饱和脂肪酸质量分数高达82.20%。DPPH自由基清除活性实验表明东魁杨梅种仁油具有较好的抗氧化活性。高不饱和脂肪酸含量、高碘值、低酸值说明东魁杨梅种仁油是一种极具潜力的天然油脂来源。

致谢：本文得到了浙江中医药大学中医药科学院医学科研中心公共平台盛正华老师、王林燕老师、关旸老师、王博老师的帮助与支持，以及浙江中医药大学中医药科学院医学科研中心公共平台提供的技术协助，特此感谢！