高温-复合酶法改性小米糠膳食纤维工艺优化及结构与功能分析

丁彩云，糟 帆，马玉婷，刘 军，刘敦华，傅 婧

(宁夏大学食品与葡萄酒学院，银川 750021)

小米糠是小米加工脱壳后的副产物，营养成分丰富[1]，尤其膳食纤维(DF)质量分数在18%以上[2]。目前大部分小米糠只是直接或经过粗加工后用作畜禽饲料，产品附加值很低。

研究表明膳食纤维具有降糖降脂、调节血压、调节肠道菌群、提高免疫力等生理功能[3]。根据在水中的溶解程度，DF分为可溶性膳食纤维(SDF)与不可溶性膳食纤维(IDF)，相比IDF，SDF具有更多的功能特性[4]。因此，通过膳食纤维改性来制备SDF具有现实意义。DF的改性方法主要有物理、生物和化学改性。化学改性可以在一定程度上改善膳食纤维的结构，但化学试剂的引入可能会给人体带来安全隐患。物理-生物改性工艺简单、反应条件温和、专一性强、对设备要求低且环境友好，从而具有良好研究前景。Song等[5]通过挤压后在纤维素酶20 U/g，pH 4.5，温度为50 ℃下持续处理240 min，提高了竹笋膳食纤维中SDF含量(22.7 g/100 g)，发现纤维素酶能够增加功能基团的暴露，从而提高阳离子交换能力、葡萄糖和胆固醇吸附能力。Liu等[6]将5%的纤维素酶与经过预水洗结合α-淀粉酶、碱性酶处理后的米糠膳食纤维混合，以料液比1∶15加入乙酸和乙酸钠混合液，在沸水中水浴30min得到纤维素酶改性米糠膳食纤维，发现经改性后DF的保水性、保油性、膨胀性、胆固醇和葡萄糖吸附能力有所提高，并降低了其乳化能力和葡萄糖透析延迟指数。郭天时等[7]通过木聚糖酶结合微粉作用对脱脂米糠膳食纤维改性大幅提高了SDF得率，同时提高了持水力、持油力。汪楠等[8]发现相较于纤维素酶、高温蒸煮单一改性，通过高温蒸煮协同纤维素酶改性竹笋膳食纤维，其粒径最小，持水力、持油力、膨胀力最大，热稳定性最强。

DF是谷物中最典型的功能性物质，目前研究主要集中在小麦、稻谷、燕麦和玉米等谷物的加工副产物上，对小米糠DF改性及改性后的理化、功能性质的研究较少。高温处理能够显著提高SDF得率，有效改善膳食纤维的理化和功能性质，关于高温改性小米糠膳食纤维鲜有研究。前期预实验分析对比了纤维素酶、木聚糖酶、α-淀粉酶、蛋白酶改性后SDF的得率，结果发现纤维素酶和木聚糖酶复合改性后SDF得率最高。本研究通过高温-复合酶法改性，提高SDF得率并分析其结构和功能特性，以期为小米的综合利用及小米糠可溶性膳食纤维的制备和功能性食品的开发提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

小米糠；木聚糖酶(5 000 U/g)、纤维素酶(10 000 U/g)、耐高温α-淀粉酶(40 000 U/g)、糖化酶(100 000 U/g)和中性蛋白酶(200 000 U/g)；氢氧化钠、盐酸、胆固醇、邻苯二甲醛、正己烷、浓硫酸、冰乙酸等，均为分析纯。

1.1.2 主要仪器设备

SE750高速粉碎机，V-5100可见分光光度计，FD-1A-50真空冷冻干燥机RE-2000A型旋转蒸发器，TDL-5-A型低速台式大容量离心机，SZF-06A型脂肪测定仪。

1.2 方法

1.2.1 小米糠总DF制备

参考Zheng等[9]和Dhital等[10]的方法。小米糠粉碎过60目筛，正己烷回流脱脂。称取干燥脱脂米糠以料液比1∶10加蒸馏水，调pH至4.5，60 ℃水浴搅拌2 h去除植酸，3 500 r/min离心20 min，去上清液；沉淀按料液比1∶12加蒸馏水糊化(95 ℃，30 min)，加入高温α-淀粉酶酶解(pH 6.5，95 ℃，30 min)，直至碘液不变蓝为止；糖化酶酶解(pH 4.0～4.5，60 ℃，30 min)；中性蛋白酶酶解(pH 7.0～7.8，60 ℃，90 min)，沸水浴10 min灭酶，3 500 r/min离心 20 min，沉淀于60 ℃真空干燥，得到小米糠总膳食纤维(DF)。

1.2.2 小米糠DF的高温预处理

将小米糠总膳食纤维(DF)和蒸馏水按一定比例放入锥形瓶后，置于立式蒸汽压力灭菌锅内进行高温改性(120 ℃，20 min)。然后旋转蒸发浓缩，将浓缩液冷冻干燥粉碎，制得高温改性小米糠膳食纤维(TDF)。

1.2.3 高温-复合酶法改性小米糠膳食纤维[11,12]

在1.2.2高温预处理的基础上进行复合酶法改性。以料液比1∶15加蒸馏水，调节pH值4.5及适宜温度后加入酶，持续搅拌1.5 h后灭酶，4倍无水乙醇沉淀12 h，3 500 r/min离心得沉淀，真空冷冻干燥并研磨制得高温-复合酶改性膳食纤维(T-EDF)。以小米糠SDF得率为指标，分别考察高温-复合酶法的改性条件。

SDF得率=SD质量/原料质量×100%。

1.2.4 高温-复合酶法改性小米糠膳食纤维的响应面优化实验

采用Box-Behnken实验原理，取复合酶比例、复合酶添加量、酶解时间和酶解温度4个因素为自变量，以SDF得率为响应值，进行四因素三水平的Box-Behnken实验，见表1。

表1 响应面实验因素与水平

1.2.5 改性前后小米糠膳食纤维的结构检测与分析

1.2.5.1 色度分析

参照参考文献[13]。记录L*值、a*值及 b*值，L*值代表亮度及暗度，a*值表示红度(+)及绿度(-)，而 b*值代表蓝度(-)及黄度(+)。

1.2.5.2 膳食纤维微观结构表征

取适量小米糠、DF、TDF及T-EDF样品置于玻璃片，在放大倍数200、1 000及2 000倍的条件下，通过扫描电镜观察样品的表观结构。

1.2.5.3 纤维样品分子结构测定

参照李雁等[14]的方法。分别取适量小米糠、DF、TDF及T-EDF与KBr按1∶100的比例混合并研磨均匀，然后在7 MPa的条件下压制成薄片。

1.2.5.4 纤维样品结晶度测定

取适量小米糠及几种膳食纤维粉末置于样品架，用PW-1710型 X射线衍射仪进行扫描分析，观察样品出峰位置和形状，用Origin 7.5软件计算其结晶度。

1.2.6 改性前后小米糠膳食纤维的功能特性研究

1.2.6.1 葡萄糖吸附能力测定

参照刘欢等[15]的方法并做修改。

1.2.6.2 胆固醇吸附性的测定

分别称取0.5 g小米糠、DF、TDF、T-EDF于50 mL烧杯中，加入25 mL搅打均匀的蛋黄乳液，调pH至2和7，于37 ℃水域摇床振荡2 h。4 000 r/min离心10 min。取上清液1 mL，显色反应后在波长570 nm处测定其吸光度。

1.2.6.3 阳离子交换能力

分别称取0.5 g小米糠、DF、TDF、T-EDF于烧杯中，加入50 mL 0.1 mol/L HCl于4 ℃放置过夜，3 000 r/min离心10 min，蒸馏水洗涤数次除去Cl-，将残渣冷冻干燥。称取0.25 g经处理的样品加入100 mL 15% NaCl溶液，用0.1 mol/L NaOH溶液滴定(酚酞作指示剂)，振摇5 min仍不褪色为滴定终点，不加样品的做空白。

1.2.6.4 α-淀粉酶抑制能力测定

参照吕静[16]的方法并做修改。

1.2.7 数据统计

采用Origin 2018、SPSS12.00软件进行单因素差异分析，以P<0.05为差异具有统计学意义，响应面实验用DesignExpert.V8.0.6.1软件作图及分析数据。实验结果用均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 小米糠及总DF基本营养成分分析

由表2可知，小米糠含有丰富的营养物质，以DF为主。DF经酶制备后，膳食纤维纯度增加了36.55%，相比黄冬云等[12]经脱脂处理的膳食纤维纯度增加了9.82%。小米糠和DF中各营养成分含量均存在显著性差异(P<0.01)，其中，蛋白质、淀粉去除率达到86.35%、94.83%，说明DF制备过程中杂质去除较为彻底。

表2 小米糠和 DF 中主要营养成分含量(g/100 g)

2.2 高温-复合酶法改性小米糠膳食纤维的单因素实验

图1是高温-复合酶法改性小米糠膳食纤维的单因素实验结果。当木聚糖酶是纤维素酶的1.5倍时，SDF得率达到最大，是因为木聚糖酶将不溶性的半纤维素降解为可溶性的，因此SDF得率升高；但当木聚糖酶大于纤维素酶的1.5倍时，SDF得率下降，可能是半纤维素降解的速度超过了其生成速度[17]。因此纤维素酶与木聚糖酶的比例为1∶1.5时为最佳。

图1 T-EDF的单因素实验结果

复合酶用量在1%～2%的过程中，SDF得率显著增大，且在2%处达到最大。这可能是由于复合酶促进纤维素水解生成了单糖、可溶性多糖等物质[18]。当复合酶用量高于2%，SDF继续降解为小分子物质，得率随之下降。选择复合酶用量为2%。

随反应时间增加，SDF得率先增后降，当反应时间在1.5 h时SDF得率达到最大值，可能是因为适当的酶解时间可促进纤维素将不溶性大分子水解为可溶性小分子物质；而随酶解时间的延长，SDF继续降解但醇沉却不能析出，因此SDF得率下降[19]。酶解时间选择1.5 h为最佳。

此外，随酶解温度的升高，SDF得率亦呈先增后降的趋势。从40～50 ℃的过程中，SDF得率升高和温度与酶活性相关，温度太低导致酶活性受抑制；在50 ℃时，酶活性最强，反应速度最快，SDF得率最高；但超过50 ℃后，酶变性甚至失活，SDF得率下降。选择酶解温度50 ℃为最适。

2.3 高温-复合酶改性小米糠膳食纤维的响应面优化实验

2.3.1 响应面优化实验结果

高温-复合酶法改性小米糠膳食纤维的响应面优化实验结果如表3所示，并利用Design-Expert 8.0.6软件分析二次回归参数模型，结果如表4所示。

表3 Box-Behnken实验设计方案及结果

由表3可见，整体模型P<0.000 1，二次方程模型极显著，且失拟项P为0.288 7不显著，说明回归模型拟合度较好，实验误差小。R2为0.948 2，大于90%，相关性较好，说明此模型能够反映响应值的变化，可用该模型对小米糠膳食纤维高温-复合酶法改性的结果进行分析和预测[20]。由表4可得各因素与响应值关系的四元二次回归方程为：

表4 回归模型系数的显著性检验

Y=75.19+0.92X1+0.1X2+9.43X3+0.40X4+0.16X1X2+0.036X1X3+0.24X1X4+0.053X2X3+0.15X2X4+0.23X3X4-27.14X12-17.40X22-34.03X32-19.26X42。说明影响SDF得率大小的顺序为酶解时间>复合酶比例>酶解温度>复合酶用量。

2.3.2 各因素两两交互作用对 SDF得率的影响

任意因素固定不变(0水平)的条件下，比较各因素两两交互对SDF得率的影响，结果如图2所示。各因素交互作用的等高线呈椭圆形，说明交互作用显著。通过软件对模型分析确定最佳工艺条件为：复合酶比例1.82∶1，复合酶质量分数1.99%，酶解温度 49.93 ℃，酶解时间1.60 h，预测SDF得率为17.39%。为了验证响应面模型的可靠性，同时考虑实际操作，选择最佳工艺参数为复合酶比例2∶1，复合酶用量2%，酶解温度 50 ℃，酶解时间1.50 h，并在此工艺参数下重复3次验证实验，得到SDF的实际得率为(17.27±1.57)%，与理论值接近且重复性较好，说明此回归模型具有可靠性和有效性。

图2 各因素交互作用对SDF得率影响的响应面图

2.4 改性前后膳食纤维色度测定

如表5所示，脱脂小米糠改性后，L*值均有下降。然而，纤维样品的a*值及b*值则因改性方式不同而有不同程度的增加，色度测定表明膳食纤维经过两种改性后均可轻微提高样品颜色。膳食纤维颜色发生改变的原因可能是粒径、表面粗糙程度、内容物的变化等，但是改性前后膳食纤维粉末均为微黄色。

表5 脱脂小米糠、DF、TDF及T-EDF的色度

2.5 改性前后小米糠的微观结构分析

扫描电镜可观测电子束照射到样品表面的凹凸情况，从而分析改性后膳食纤维的结构特性，确定其表面形态。图3为脱脂小米糠和膳食纤维的微观结构图，可以看出4种样品颗粒表面形态发生显著变化。脱脂小米糠呈现出不规则、表面光滑无孔洞的片状结构，表面附着大量球状和块状物质，可能是分离纯化后残留的蛋白质聚合物及小淀粉颗粒[21]。DF呈现出规律、紧凑的片状结构，表面光滑规整，内部则是中空的多孔网状结构分布。经过高温α-淀粉酶和蛋白酶处理，样品表面只残存很少的圆球状颗粒，说明杂质去除较为彻底。TDF的纤维表面明显光滑，内部呈网状结构。而T-EDF表面粗糙，帚化微纤维增加[22]，复合酶的作用使纤维表面水解，促进了扁平带状结构的破裂和脱离。使得膳食纤维结构表现出更疏松的状态，形成更强的毛细管吸附作用，从而改善膳食纤维的功能特性[23]。

图3 脱脂小米糠及其膳食纤维的扫描电子显微镜图(×2 000)

2.6 改性前后小米糠的红外光谱分析

如图4所示，改性前后膳食纤维红外光谱图相似，但是部分吸收峰有所变化。膳食纤维的红外光谱图(4 000～500 cm-1)中均包含了烃基、吡喃糖环所含乙醇基的C—O伸缩振动，吡喃糖环状结构的特征键C—O—C的不对称收缩振动，脂肪族类C—H对称和非对称伸缩振动，C—H不对称和对称弯曲，C—C伸缩振动等一系列典型多聚糖的吸收峰[14]。在3 400～3 300 cm-1处的强吸收峰是O—H基团，其主要源自果胶和纤维素，此外，T-EDF在3 423 cm-1处的峰迁移至3 404.3 cm-1处，吸收峰迁移和强度增强的原因可能是高温-复合酶处理后纤维素分子结构被破坏，去除了多数的木质素[24]，部分糖苷键断裂形成氢键。改性前后的4种样品在2 924 cm-1和1 742 cm-1处有弱吸收峰，均有C—H的反对称拉伸和弯曲振动引起，主要来源于部分多糖的亚甲基和羰基。综上，经过改性后的膳食纤维的吸收峰无明显变化，说明无基本化学结构被破坏。吸收峰强度的差异是由于含量或结合程度不同，同时说明高温-复合酶法能有效去除原纤维中无定形组分。

图4 脱脂小米糠及其膳食纤维的红外光谱图

2.7 改性膳食纤维的X-RD分析

图5为脱脂小米糠及其改性膳食纤维的XRD图。脱脂小米糠在扫描角度2θ为22.86°处有明显的结晶衍射峰，同时在15.16°处有较弱的衍射峰，这些峰均表明脱脂小米糠具有典型的纤维素Ⅰ型的X射线衍射曲线特征[25]，为结晶区与非结晶区两相共存的状态。DF、TDF以及T-EDF的XRD图谱形状相似，表明其结晶特征变化不大，其主衍射峰分别在2θ为21.88°、21.62°和22°处，且在34.5°附近具有微弱的衍射峰，说明三者的晶体类型均为纤维素I型，为结晶区与非结晶区两相共存的状态[26]；另外，根据软件曲线法拟合计算出脱脂小米糠、DF、TDF和T-EDF的结晶度分别为33.76%、35.01%、37.78%和55.56%，即改性后样品的结晶度均高于小米糠，可能与小米糠中蛋白质残基的去除有关，同时表明无定形区的纤维素更易遭到破坏。T-EDF结晶度较高，推测是复合酶作用于DF中的半纤维素以及纤维素中的无定形区所致[27]。

图5 脱脂小米糠及膳食纤维XRD图谱

2.8 改性膳食纤维的功能性质

由图6a可知，经过酶法提取后的DF较脱脂小米糠葡萄糖吸附能力显著提高(P<0.05)，而经高温-复合酶改性处理后吸附能力略有提高。改性处理使膳食纤维表面孔隙增大，结构更疏松，功能基团暴露，葡萄糖吸附能力随之增大[28]。所有经过预处理的膳食纤维都能吸附少量的葡萄糖，这就表明小米糠膳食纤维能够在一定程度上降低小肠中的葡萄糖浓度。

由图6b可知，胆固醇的吸附能力在中性条件(模拟小肠环境)明显强于酸性环境(模拟胃的pH环境)，这与多数研究结果一致，可能是大量的H+与胆固醇携带的部分正电荷产生相互排斥的作用，导致吸附能力有所下降[29,30]。改性后膳食纤维的胆固醇吸附能力均大于改性前的吸附能力，在pH=2时，T-EDF的胆固醇吸附性较强，分别是脱脂小米糠、DF、的1.29、1.15倍，但没有TDF的吸附性高，可能是由于酸性条件下高温使得膳食纤维内部基团暴露更易于胆固醇结合；在pH=7时，T-EDF的胆固醇吸附性最强，分别是脱脂小米糠、DF、TDF的1.55、1.36、1.22倍。

膳食纤维分子结构中存在大量羧基和羟基的侧链基团，能够与阳离子可逆交换。由图6c可观察到，阳离子交换能力大小依次为：T-EDF>TDF>DF>脱脂小米糠，说明改性处理可以提高阳离子交换能力，这可能是由于改性处理使膳食纤维粒径减小，表面更光滑，从而表面糖醛酸结合位点暴露，更易于阳离子交换。这与傅里叶红外光谱测定结果一致[31]。

由图6d可知，对照组葡萄糖生成含量相比(1.1 mg/g)，4种样品的添加均使葡萄糖含量降低，表明4种样品对α-淀粉酶均有一定的抑制作用。脱脂小米糠对α-淀粉酶的抑制率较其他3种样品最低，是因为膳食纤维可以包埋淀粉和淀粉酶从而限制淀粉与淀粉酶之间的相互作用，甚至膳食纤维表面可能附着抑制剂，从而可以直接抑制酶的活性[32]。

图6 脱脂小米糠及膳食纤维功能特性

3 结论

通过Box-Behnken实验设计，结合响应面分析及实际操作，最终确定高温-复合酶法改性脱脂小米糠膳食纤维的最优工艺条件为复合酶比例2∶1、复合酶2%、时间1.50 h及温度50 ℃。在此条件下，SDF得率达到(17.27±1.57)%，比高温改性小米糠SDF提高了6.48%。

通过红外光谱和X射线衍射分析结果显示，改性前后膳食纤维的结构具有明显的糖类特征吸收峰，且改性前后的特征吸收峰的峰形、位置无明显变化；改性后XRD图谱相似，晶体类型不变，均为纤维素Ⅰ型，但是结晶度上升，表明改性后膳食纤维表面结构被破坏，使纤维素结晶区暴露。此外，脱脂小米糠改性后其葡萄糖、胆固醇吸附能力及阳离子交换能力显著增强。