糖基化-酰化菜籽蛋白抗菌水凝胶的制备与表征

王志高，陶 璇，张倩玉，何 荣，鞠兴荣

(南京财经大学食品科学与工程学院；江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心；江苏高校粮油质量安全控制及深加工重点实验室，南京 210023)

菜籽粕是油菜籽提取油脂(压榨或溶剂浸出)后的副产物，年产量近千万吨。菜籽粕含有35%～45%的粗蛋白，且具有丰富的蛋氨酸、赖氨酸和胱氨酸，不仅氨基酸平衡优于其他的植物蛋白，其营养价值也可与酪蛋白和动物蛋白相媲美。此外，菜籽蛋白在食品的加工、储藏及配制等过程中表现出一定的成膜性、起泡性、持水性、溶解性、凝胶性和乳化性等功能特性[1, 2]，是我国优质的植物蛋白源，有极高的开发利用价值。研究发现菜籽蛋白可以吸附大于自身质量近4倍的水，吸水能力要明显优于商业化较成熟的大豆蛋白[3]。然而，天然的菜籽蛋白在pH 4～9之间的溶解性较差[4, 5]，其凝胶形成能力也低于大豆蛋白[6]。这说明菜籽蛋白具有制备水凝胶的先天条件，只是溶解性、凝胶性等还需进一步改善，若能对其功能进行修饰或改进，将大大提高菜籽蛋白在食品、农业、生物医学等方面的利用度。

凝胶性是蛋白质重要的功能性质之一，被作为评估蛋白衍生产品的重要指标。目前，改善菜籽蛋白凝胶性的方法中通常有化学、物理及生物方法。化学改性主要通过化学反应改变聚合物的物理化学性质，方法包括酸碱化、脱酰胺、酰基化和糖基化等[7]。其中，酰基化在食品加工方面的应用较为广泛，其本质是酰化剂与蛋白质分子中游离的氨基或羟基之间发生亲核取代从而改变蛋白质的功能性质[8]。酰基化能改善菜籽蛋白的凝胶特性[9]，但仅仅是加强了菜籽蛋白的凝胶形成能力，无法有效提高凝胶强度和凝胶性能。目前，还有研究人员发现糖基化可以改善蛋白质的乳化、凝胶、溶解和热稳定等性能[10]。壳聚糖、葡聚糖和纤维素这类天然多糖，具有良好的生物相容性和生物可降解性，其主链上含有的许多游离羟基易于修饰和交联，适合酰化菜籽蛋白的糖基化修饰。菜籽蛋白由于含有的大量赖氨酸，在糖基化反应时能促进稳定优良凝胶的形成。

目前，这类植物蛋白基水凝胶因其具有良好的气体交换、保湿、生物相容性、低毒和可降解等性质[11]，被用作伤口敷料。凝胶在我国长期处于供不应求的状态，需求量保持持续高速增长状态，但其机械性和抑菌效果差，存在被微生物感染的风险，不利于伤口愈合[12, 13]。聚六亚甲基双胍盐酸盐(PHMB)是一种无毒、无致突变性的细胞膜活性抗菌剂，对细菌繁殖体和真菌的杀灭作用均较好[14]。其抑菌机理为PHMB作为聚阳离子型化合物，可吸附于带有负电荷的微生物表面，并通过跨膜运输至细胞质中的磷脂双分子层与带负电磷酸基结合，以此改变细胞膜的选择透过性，阻止细胞分裂繁殖，破坏细胞代谢，从而杀死微生物[15]。

本研究选择用琥珀酸酐、羧甲基壳聚糖(CMCS)和对菜籽分离蛋白进行酰基化-糖基化协同处理，然后将PHMB作为抗菌剂加载到羧甲基壳聚糖-酰化菜籽蛋白水凝胶上，探究PHMB加载浓度与菜籽蛋白水凝胶的抑菌效果之间的关系，以及加载PHMB前后凝胶的溶胀性、热稳定性和透气性的变化情况，并通过傅里叶红外光谱和X射线衍射分析凝胶内部结构的变化。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菜籽粕、CMCS、PHMB、无水乙醇、溴化钾、氯化钠、氯化钾、琥珀酸酐、PBS、Tris-甘氨酸(Tris-Gly)、胰蛋白胨、酵母粉、琼脂粉、金黄色葡萄球菌(CMCC26003)、铜绿假单胞菌菌种(ATCC 9027)、聚四氟乙烯带，所用化学试剂均为优级纯。

1.2 仪器与设备

HWCL-3型恒温磁力搅拌器，HHS-2型数显恒温水浴锅，AL204型分析天平，GL-21M型高速冷冻离心机，AE150型pH测定仪，Hirayama HVE-50型高温高压蒸汽灭菌锅，crystal IS-RDV1型恒温振荡器，WIGGENSWCI-180型CO2恒温培养箱，Q2000型差示扫描量热仪，SW-CJ-2FD型洁净工作台，Tensor 27型傅里叶红外光谱仪，RigakuUltima IV型X射线衍射仪，Spectramax M2e型多功能酶标仪。

1.3 实验方法

1.3.1 菜籽分离蛋白的制备

将菜籽粕按比例(1∶10)溶于去离子水，后用1 mol/L的NaOH溶液调节pH至11，磁力搅拌后(转数，3 h，50 ℃)，离心收集上清液(10 000 g，30 min，4 ℃)。用1 mol/L的HCl溶液调节上清液的pH至4.5，在室温下静置沉淀2 h，后离心收集沉淀(1 000 g，30 min，4 ℃)，并用无水乙醇洗涤沉淀去除酚类物质。最后将沉淀冷冻干燥后即得到菜籽分离蛋白。

1.3.2 酰化菜籽蛋白的制备

将得到的菜籽分离蛋白溶于去离子水中，制备2%的菜籽蛋白溶液。用2 mol/L的NaOH溶液调节蛋白溶液的pH至10。缓慢加入菜籽蛋白质量5%的琥珀酸酐进行反应，反应时用2 mol/L的NaOH溶液维持溶液pH为10。反应结束将混合溶液用截留分子量为10 ku的透析袋透析48 h，得到酰化度为5%的酰化菜籽蛋白(ARPI)溶液，最后将样品冷冻干燥备用，ARPI的纯度为80%。

1.3.3 糖基化-酰化协同修饰制备菜籽蛋白水凝胶

首先，将适量的ARPI样品和CMCS(以ARPI质量的10%计)溶于质量分数为0.5%的NaCl溶液中，加入菜籽蛋白为100 U/g的TG酶催化反应的进行，得到酰化菜籽蛋白质量分数为15%的悬浮液。用1 mol/L的NaOH试剂调节pH至9，均匀混合后将3 mL悬液转移到直径为28 mm、高度为57 mm的圆柱形玻璃小瓶中。将小瓶放在90 ℃的水浴中加热30 min，然后立即在冰浴中冷却到室温，在4 ℃的条件下保存过夜，得糖基化-酰化协同修饰菜籽蛋白水凝胶。

1.3.4 PHMB-CMCS-ARPI水凝胶的制备

在溶解时加入以ARPI质量0.1%～0.2%的PHMB于质量分数为0.5%的NaCl溶液中，后续实验步骤相同。

1.3.5 抑菌活性的测试

1.3.5.1 培养基的配制

LB液体培养基：量取100 mL的蒸馏水倒入250 mL的锥形瓶中，称取1 g胰蛋白胨、0.5 g酵母粉和1 g氯化钠并加入锥形瓶中混匀，置于高温高压蒸汽灭菌锅中在121 ℃条件下灭菌15 min后待用。

LB固体培养基：量取100 mL的蒸馏水倒入250 mL的锥形瓶中，称取1 g胰蛋白胨、0.5 g酵母粉、1 g氯化钠和1.5 g琼脂粉并加入锥形瓶中混匀，置于高温高压蒸汽灭菌锅中在121 ℃条件下灭菌15 min。培养基冷却至60 ℃左右后，倒入一次性培养皿(每个培养皿15 mL培养基)，充分凝固后待用。

1.3.5.2 细菌悬液的制备

在3支12 mL的细菌培养管中分别加入3 mL的LB液体培养基，然后2支培养管各加入从金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌固体培养基上挑取的单菌落，另一支作空白对照。3支培养管在37 ℃、200 r/min条件下振荡培养过夜，多功能酶标仪上测得菌液OD460值[16]和OD585值[17](金黄色葡萄球菌OD460值与铜绿假单胞菌OD585值均为0.91，前者对应菌液浓度为4.1×108CFU/mL；后者对应菌液浓度为 2.23×108CFU/mL)。

1.3.5.3 样品的处理

凝胶样品在75%乙醇中浸泡30 min，待乙醇充分挥发后将凝胶按0.1 g/mL的比例加入无菌PBS溶液，静置(37 ℃，48 h)后得凝胶浸提液。凝胶浸提液用0.22 μm过滤器过滤至无菌离心管中备用。

1.3.5.4 抑菌圈的测试

用无菌PBS溶液将菌液的菌落数稀释至1×106CFU/mL，将100 μL菌液均匀涂布在LB固体培养基平板上，再用9 mm无菌打孔器打孔。按序将样品(每孔100 μL)加入孔中。最后，将平板置于37 ℃的恒温培养箱内培养18 h，后取出拍照并测得抑菌圈的直径。

1.3.6 溶胀性能的测试

将冻干后的菜籽蛋白水凝胶样品制成质量相等的近似形状，分别浸泡于pH为4、7、10的去离子水(37 ℃)中，间隔预设时间(t)后取出称重直至样品达到溶胀平衡(质量恒定)。根据式(1)计算水凝胶的吸水量(S)：

吸水量=(mt-m0)/m0

(1)

式中：m0为干凝胶的质量/g；mt为t时刻水凝胶的质量/g。

1.3.7 透气性能的测试

取开口直径为15 mm的圆底玻璃瓶，向瓶中加入10 mL的去离子水，将菜籽蛋白水凝胶样品切成厚度为3 mm、边长为20 mm的正方形，覆盖在圆底玻璃瓶口上并在瓶口边缘用聚四氟乙烯带密封以免水分流失。测量各个玻璃瓶的总质量，然后将玻璃瓶放入37 ℃烘箱中，24 h后取出再次测量玻璃瓶的质量，按式(2)计算水蒸气透过率[g/(m2·d)]，以评估水凝胶的透气性能：

水蒸气透过率=(ms-mf)/A

(2)

式中：A为瓶口面积/m2；ms为覆盖有样品的玻璃瓶的初始质量/g；mf为玻璃瓶最终质量/g。

1.3.8 热重测试

将菜籽蛋白水凝胶样品冻干，在氮气充分的条件下用热重分析仪以20 ℃/min的速度将室温升高至800 ℃，记录下凝胶样品的热重(TG)曲线和导数热重(DTG)曲线。

1.3.9 傅里叶红外光谱的测试

将冷冻干燥的水凝胶样品研磨过筛(120目)，将样品与溴化钾粉末充分混合压成片剂。用Tensor 27傅里叶红外光谱仪在400～4 000 cm-1范围内对样品粉末的红外光谱进行测定[18]。

1.3.10 X射线衍射的测试

对菜籽蛋白水凝胶进行X射线衍射的测试：铜靶，石墨单色器，电流100 mA，电压40 kV，发射狭缝为1°，防散射狭缝为19°，接收狭缝为0.15 mm，扫描区间为5°～40°，扫描速度为5(°)/min，使用MDI计算2θ/θ连续扫描，步长为0.02°。用JADE6.5软件进行分析。

1.3.11 数据分析

研究中每个实验至少重复3次，数据分析由SPSS 23.0软件完成。实验数据用均值±标准差描述，采用Duncan 检验对数据进行单因素方差分析，当P<0.05时认为差异具有显著性。

2 结果与分析

2.1 菜籽蛋白水凝胶的抗菌性能

金黄色葡萄球菌(G+)和铜绿假单细胞菌(G-)是较为常见的伤口部位易感染细菌，本研究选取这2种细菌来检测加载PHMB前后菜籽蛋白水凝胶的抗菌性能。检测结果如表1所示，细菌的浓度为1×106CFU/mL，在加载PHMB前，尽管CMCS本身具有抗菌性能，但其在与酰化菜籽蛋白交联后形成的稳定紧密网状结构对壳聚糖的细菌吸附作用形成阻碍，CMCS-ARPI凝胶浸提液仍然表现出一定的抗菌效果，抗菌性相较于单独的PHMB略强。王志高[19]研究发现酰化菜籽蛋白在其等电点以上的ζ电位明显低于未改性菜籽蛋白的ζ电位，表明酰化后阴离子丁二酰基部分取代了菜籽蛋白中的阳离子ε-氨基基团，使得酰化菜籽蛋白的电负性得到加强。猜测PHMB是以静电吸附的方式与CMCS-ARPI水凝胶结合。随着PHMB的加载和浓度的提升，抑菌效果愈发增强，测得的抑菌圈直径逐渐变大，说明PHMB成功加载到了CMCS-ARPI凝胶上。以金黄色葡萄球菌为例，0.20%的PHMB-CMCS-ARPI水凝胶浸提液的抑菌圈直径为8 mm，凝胶样品表现出的抗菌性能比文献报道的聚氨酯/白及多糖复合水凝胶更强[20]。

表1 抑菌圈直径/mm

2.2 不同pH条件下菜籽蛋白水凝胶的溶胀性能

水凝胶敷料的溶胀性能是影响其在生物医药领域内应用的一个重要因素，适合的溶胀比更有利于伤口愈合，过低的溶胀比可能无法为伤口提供温和湿润的恢复环境，过高的溶胀比可能会增加伤口感染的可能性[21]。加载PHMB前后以及不同加载量下的菜籽蛋白水凝胶在不同pH条件下去离子水中的溶胀性能如图1所示，4种样品在相同pH条件下去离子水中的溶胀率没有显著差异。其中加载量为0.20%的PHMB-CMCS-ARPI水凝胶溶胀率较高，在pH为4、7、10条件下去离子水中的溶胀率分别为6.01、8.83、9.19 g/g。与抗菌型壳聚糖基水凝胶的溶胀比[22]相比，PHMB-CMCS-ARPI菜籽蛋白水凝胶溶胀性能更好，且表现出更适宜的吸湿速率，能够为伤口提供湿润而干爽的恢复环境。另外猜测PHMB的加载是通过静电吸附完成的，因而不会对水凝胶的网状多孔结构产生影响，相反，可能会在一定程度上增加凝胶网络结构的密度。

注：不同字母(a～c)表示数据之间存在显著性差异(P<0.05)，余同。

和其他pH条件下相比，所有菜籽蛋白水凝胶样品在pH为4的条件下溶胀率都较小，可能是由于羧甲基壳聚糖和酰化菜籽蛋白在酸性溶液中接受了质子，大分子链主要以正离子状态存在，使得ARPI、CMCS和PHMB间的电荷排斥效应增加，大分子链更易于展开并迅速与极性水分子产生作用，更快达到溶胀平衡[23]，因此体外溶胀率明显降低。而在pH为7和10条件下，菜籽蛋白水凝胶的溶胀率依次增加，表明溶胀介质的pH对本研究所制备的菜籽蛋白复合抗菌水凝胶的溶胀性能有明显影响。当pH为10时样品的溶胀率最高，这是—COOH基团的静电排斥作用所引起的。本实验制备的菜籽蛋白水凝胶在较宽的pH范围内都具有较好的溶胀性能，且加载抗菌剂PHMB对凝胶的溶胀性能基本没有影响，因此0.20% PHMB-CMCS-ARPI凝胶可以用于吸收伤口渗出液，为创面保持湿润温和的愈合环境。

2.3 菜籽蛋白水凝胶的热稳定性能

图2为菜籽蛋白水凝胶样品的热失重(TG)和导数热重(DTG)曲线。如图2所示3种蛋白凝胶粉末在314 ℃条件下均出现了蛋白凝胶分解的最大失重峰。其中，CMCS-ARPI凝胶和PHMB-CMCS-ARPI凝胶的热损失率均小于ARPI凝胶，说明糖基化修饰提高了凝胶样品的热稳定性能。姜梦云等[24]在研究鱼贝肌肉分离蛋白经过糖基化修饰后的热稳定性能变化时得出了相同结论。未加载PHMB的蛋白凝胶粉末的DTG曲线在50～150 ℃范围内出现了较宽的水分蒸发峰，这是由于凝胶具有亲水性[11]，可与空气中的水分子结合，故而蛋白凝胶粉末的含水量较多；而在180～210 ℃范围内的蛋白质有一定程度的分解。加载PHMB的蛋白凝胶粉末的DTG曲线在50～150 ℃范围内的水分蒸发区域质量损失较小，猜测是由于静电吸引加载的PHMB增加了凝胶结构的交联密度及稳定性，从而防止蛋白凝胶粉末与空气中的水分子迅速结合；而在180～245 ℃范围内的蛋白凝胶粉末质量损失显著大于未加载PHMB之前的凝胶粉末质量，这可能是高温下PHMB分解所导致的；在260～407 ℃范围内出现的较宽质量损失峰是PHMB、CMCS和ARPI在加热过程中分解峰叠加在一起产生的结果。

图2 PHMB对凝胶热稳定性能的影响

2.4 菜籽蛋白水凝胶的透气性能

保证适当的表面湿润度和失水率，理想伤口敷料的水蒸气透过率应在2 000～2 500 g/(m2·d)范围内[25, 26]。图3为凝胶样品的水蒸气透过率。在无覆盖物时样品的水蒸气蒸发速率为(9 244.3±324.5)g/(m2·d)，如此条件易导致伤口处过快的水分流失，使得上皮细胞生长缓慢，不利于伤口愈合。而市售的传统医用胶带水蒸气透过率为(682±59.2)g/(m2·d)，其表面致密且具有较高的密封性，需要使用者经常更换以保证伤口部位合适的透气性和避免细菌感染。ARPI凝胶、CMCS-ARPI凝胶和0.2%PHMB-CMCS-ARPI凝胶的水蒸气透过率分别为(2 436.6±262.8)、(2 136.6±119.2)、(1 972.4±164.3)g/(m2·d)，虽然糖基化修饰和抗菌剂PHMB的加载都使得凝胶结构更加致密，且在一定程度上对凝胶的透气性有所影响，但是0.2% PHMB-CMCS-ARPI凝胶还是表现出了较为理想的透气性能，略高于不同浓度的抗菌型聚乙烯醇基水凝胶材料在湿态下的水蒸气透过率[27]，基本达到了医用伤口敷料的要求。

注：横坐标中4、5分别为CMCS-ARPI、0.2%PHMH-CMCS-ARPI。

2.5 菜籽蛋白水凝胶的傅里叶红外光谱分析

傅里叶红外光谱是分析混合物分子之间的相互作用及官能团的变化的主要方法。加载0.2%PHMB前后菜籽蛋白水凝胶的化学结构变化如图4所示。3种改性菜籽蛋白水凝胶位于3 275 cm-1处的特征峰是—NH2基团和—OH基团的伸缩振动所引起的[28]，1 659 cm-1和1 530 cm-1附近的强峰为菜籽蛋白水凝胶在酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅱ带的吸收峰[29]。1 447 cm-1处的强峰是C—H的伸缩振动和N—H弯曲振动所引起的，是菜籽蛋白水凝胶在酰胺Ⅲ带的吸收峰。CMCS-ARPI凝胶和PHMB-CMCS-ARPI凝胶在1 079 cm-1附近的吸收峰是多糖(糖苷键中的C—O—C)的吸收峰[30]。O—H和N—H拉伸振动引起的吸收峰移动到较低的波数，表明CMCS的阳离子基团与改性菜籽蛋白的阴离子基团之间通过电荷间相互作用形成了氢键[31]，这是糖基化修饰反应的结果。2 200～2 300 cm-1范围内无—NCO的吸收峰，表明PHMB成功加载到了菜籽蛋白水凝胶样品上。

图4 ARPI、CMCS-ARPI和PHMB-CMCS-ARPI凝胶样品的红外光谱图

2.6 菜籽蛋白水凝胶的X射线衍射分析

X射线衍射分析可以用于研究物质的物相和晶体结构，因此用X衍射图分析加载PHMB前后凝胶样品的微观结构。如图5所示，ARPI、CMCS-ARPI和PHMB-CMCS-ARPI凝胶均为非晶体物质，其XRD曲线较为类似，均呈现出近似无定形的宽峰衍射，无典型结晶结构特征衍射峰，ARPI凝胶在2θ=19.2°处出现的衍射峰是菜籽蛋白的特征峰，这也是由于凝胶结构中的规整部分。

图5 ARPI、CMCS-ARPI和PHMB-CMCS-ARPI凝胶样品的X衍射图

根据布拉格定律，2dsinθ=λ，(d为平行原子平面的间距；λ为入射波的波长；θ为入射光与晶面之间的夹角)，PHMB-CMCS-ARPI凝胶中衍射峰略微左移，说明入射光与晶面之间的夹角变小了，入射波的波长不变，因此只可能是由于平行原子平面的间距变大了。而本研究中d值变大极有可能是因为晶格受到了间隙原子的作用应力而伸长了，可能是PHMB的成功加载使得晶胞参数变大，晶面间距变大。

3 结论

通过糖基化-酰化协同修饰以及热诱导法加载聚PHMB，菜籽蛋白基水凝胶的抗菌性能得到了显著提升，加载0.2% PHMB的CMCS-ARPI凝胶样品对金黄色葡萄球菌和铜绿假单细胞菌的抑菌圈直径达到8 mm和6 mm。与CMCS-ARPI凝胶相比，加载0.2% PHMB的CMCS-ARPI凝胶的溶胀率上升至9.19 g/g，热稳定性能基本不变，透气性能有所下降但仍可满足医用凝胶敷料的透气性要求，且三方面的变化均不具有显著性。傅里叶红外光谱和X射线衍射图表明加载PHMB前后菜籽蛋白水凝胶的吸水性能、热稳定性几乎没有发生变化。可以得出糖基化-酰化协同修饰及PHMB加载可以有效提高菜籽蛋白水凝胶的抗菌性能，因此改性后的菜籽蛋白水凝胶可作为伤口敷料新材料。