UPLC-MS/MS法测定美洛昔康中两个中间体杂质

孙 桐，葛雪松，张新勇，卓 静

(宿迁市食品药品检验所， 江苏 宿迁 223800)

美洛昔康(Meloxicam)，化学名4-羟基-2-甲基-N-(5-甲基-2-噻唑基)-2H-1，2-苯并噻嗪-3-羧酰胺1，1-二氧化物，是一种非类固醇解热镇痛抗炎药。由德国Boehringer Ingelheim公司于1996年首次在南非上市，具有镇痛、抗炎、解热作用，临床适用于类风湿性关节炎和疼痛性骨关节炎的对症治疗。根据美洛昔康原料药的生产工艺[1]分析，4-羟基-2-甲基-2H-1，2-苯并噻嗪-3-羧酸乙酯-1，1-二氧化物(杂质A)和2-氨基-5-甲基噻唑(杂质B)是美洛昔康合成工艺中两种重要的中间体，极有可能残留在原料药中，最终传递到成品中[2-5]。杂质A，B均有一定的毒性，而在现行的质量控制标准中，仅仅使用供试品稀释的自身对照法对杂质进行控制，具有很大的局限性。参照美国药典USP43-NF38[6]和欧洲药典EP10.0[7]，原料药中均对杂质A，B进行了单独的限度控制。为了大众用药安全，需严格控制原料药质量，结合相关文献[8-16]，建立了LC-MS/MS法同时测定美洛昔康中杂质A和杂质B。杂质A，B的结构式见图1。

图1 杂质A，杂质B结构图

1 仪器与试药

1.1 仪 器

XEVO TQ-S micro三重四级杆液质联用色谱仪，美国Waters；XP205电子天平(0.01 mg)，瑞士梅特勒，Milli-Q超纯水机，美国Millipore。

1.2 试 药

美洛昔康对照品(批号：100679-201903，含量100%)，中国食品药品检定研究院；美洛昔康杂质A对照品(批号：0301-RC-0087，含量100%)，美国CATO；美洛昔康杂质B对照品(批号：0223-RC-0093，含量95.7%)，美国CATO；美洛昔康原料药(批号：20210318，20210319，20210320)，国内某药业有限公司，甲醇(色谱纯)，德国Merk、甲酸(色谱纯)，美国ACS，水为自制超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱与质谱条件

2.1.1 色谱条件

采用ACQUITY UPLC©HSS T3 C18(2.1 mm×100 mm， 1.8 μm)色谱柱，流动相为0.1%甲酸水溶液-甲醇(45:55)，流速为0.3 mL/min，柱温35 ℃，进样盘温度10 ℃，进样体积1 μL。

2.1.2 质谱条件

采用电喷雾离子源(ESI)，多反应离子监测模式(MRM)，正离子扫描，脱溶剂温度：500 ℃，干燥气流速：15 L/min，毛细管电压：2.5 kV，质谱监测时间：0～5.9 min(系统适用性条件下监测时间：0～8 min)，其他质谱条件见表1，表1中加*的为定量离子。

表1 质谱分析参数

2.2 溶液的配制

2.2.1 供试品溶液

精密称取美洛昔康原料药约50 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得美洛昔康的供试品溶液。

2.2.2 混合对照品溶液

分别精密称取美洛昔康，杂质A和杂质B的对照品适量，用甲醇溶解并稀释至每1 mL分别含美洛昔康，杂质A和杂质B约1 μg的溶液，作为单一对照品贮备液①，②，③；精密量取单一对照品贮备液①，②，③适量，用70%甲醇水稀释至每1 mL含美洛昔康，杂质A和杂质B 均约为0.1 μg的系统适应性溶液；精密量取单一对照品贮备液②，③适量，用70%甲醇稀释至每1 mL含杂质A和杂质B均约为0.1 μg的混合对照品贮备液。

2.3 方法考察

2.3.1 专属性实验

取单一对照品贮备液①，②，③各 0.1 μL，空白溶剂(70%甲醇水)，系统适应性溶液，混合对照品贮备液和供试品溶液各 1 μL，分别注入液质联用仪，记录质谱图和色谱图，见图2，3。结果显示，各成分保留时间：杂质B 0.72 min，杂质A 5.13 min，美洛昔康6.18 min；空白溶剂对杂质无干扰，各色谱峰之间无干扰。

图2 美洛昔康及各杂质的质谱图

2.3.2 线性关系考察

精密量取“2.2.2”项下的混合对照品贮备液，用70%甲醇水稀释成含杂质A 1.03，2.06，4.12，10.32，20.64，51.50，100.30 ng/mL；杂质B 0.98，1.96，3.92，9.80，19.60，49.0，98.0 ng/mL的混合对照品溶液。取上述混合对照品溶液，分别进样，记录色谱图，以峰面积Y为纵坐标，溶液浓度X(ng/mL)，进行线性回归。杂质A，B的线性方程如下：

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Y=393.858X-200.006(r=0.9992)，杂质A在1.03～100.3 ng/mL的范围内线性关系良好

Y=1087.44X-402.125(r=0.9996)，杂质B在0.98～ 98.0 ng/mL的范围内线性关系良好。

2.3.3 定量限和检出限

取“2.2.2”项下的混合对照品贮备液，用70%甲醇水，逐级稀释，稀释到杂质A，B峰的信噪比(S/N)约为10的时候，溶液浓度作为定量限；信噪比(S/N)约为3的时候，溶液浓度作为检出限。实验结果：杂质A的检出限0.31 ng/mL，定量限0.83 ng/mL；杂质B的检出限0.15 ng/mL，定量限0.51 ng/mL。

2.3.4 精密度试验

取线性考察下混合对照品溶液(杂质A 10.32 ng/mL，杂质B 9.80 ng/mL)，连续进样6次，以峰面积计算各杂质的RSD，杂质A的RSD=2.6%(n=6)；杂质B的RSD=1.8%(n=6)，结果表明方法的精密度良好。

图3 空白溶剂(A)， 系统适应性溶液(B)， 混合对照品(C)及供试品(D)的色谱图

2.3.5 中间精密度试验

由另一位实验人员在同一台液质联用仪上做精密度试验，结合两者的结果计算RSD，杂质A的RSD=3.7%(n=12)；杂质B的RSD=2.9%(n=12)。

2.3.6 重复性试验

2.3.7 稳定性试验

配置混合对照品溶液(杂质A，B浓度均约为100 ng/mL)，在室温(20 ℃)情况下放置0，2，4，6，8后进样分析，以峰面积计算。结果显示：杂质A的RSD=3.1%(n=5)，杂质B的RSD=1.9%(n=5)，说明杂质A，B在8 h内稳定性良好。

2.3.8 耐用性试验

取美洛昔康原料药按“2.2.1”项下的方法平行配置2份供试品溶液，分别在色谱柱温度(33 ℃和37 ℃)，流动相比例[0.1%甲酸水溶液:甲醇(43:57)，0.1%甲酸水溶液：甲醇(47:53)]，流动相流速(0.29，0.31 mL/min)下进样分析，计算各杂质含量，与原有色谱条件下的含量进行比较。结果显示，当色谱条件在温度，流速，流动相比例细微变化的情况下，各杂质含量的RSD<10%，说明该方法的耐用性良好。

2.3.9 加样回收率

精密称取杂质A，B对照品适量，用70%甲醇水稀释至每1 mL含杂质A 0.207 μL，杂质B 1.016 μL的混合对照品溶液；精密称取美洛昔康原料药(批号：20210318)约50 mg，共9份，分成三组，分别置50 mL量瓶中，再取上述混合对照品4 mL (3份)，5 mL(3份)，6 mL(3份)置已加入美洛昔康的量瓶中，用70%甲醇水溶解并稀释至刻度，摇匀，进样分析，计算加样回收率，结果见表2。

表2 杂质A，B加样回收率结果(n=9)

续表2

2.4 样品含量测定

取美洛昔康原料药(20210318，20210319，20210320)，按照“2.2.1”项下的方法配置供试品溶液，按“2.1”项下的液质联用条件进样，计算杂质含量，结果见表3。

表3 杂质含量测定结果

3 讨 论

3.1 系统适应性要求

供试品溶液主成分美洛昔康含量过高，建议让美洛昔康出峰在最后，通过控制质谱监测时间在美洛昔康出峰时间之前，仅记录杂质A，B的色谱图，让美洛昔康直接以废液形式排出，以免污染质谱检测器。

3.2 流动相的选择

杂质A和B在ES+模式下离子响应强度是ES-模式下的数倍，流动相中加入甲酸铵或乙酸铵抑制杂质A和B的电离；相反，流动相中引入甲酸，有助于提供H离子，增强待测离子的强度。所以本文着重考察了甲醇-甲酸水，乙腈-甲酸水两种常见的流动相体系。乙腈-甲醇水系统，基线噪音偏高，杂质B有明显拖尾，美洛昔康峰的保留时间在杂质A和B之间，不适合。杂质B对酸灵敏，在pH值2～4情况下，离子响应强度明显提高，0.1%的甲酸完全满足实验要求。调整甲醇-甲酸水体系流动相比例，高比例水相情况下，杂质B峰型差，峰展宽偏大，有明显拖尾；高比例有机相时，杂质A与美洛昔康的分离效果变差，通过反复调整，最终确定流动相比例为甲醇：0.1%甲酸水=55:45。

3.3 杂质B同为降解产物的验证

由图2可见，美洛昔康的子离子(m/z=115.0)与杂质B的母离子(m/z=115.0)质量数一致，推测杂质B也是美洛昔康的降解产物。美洛昔康对酸碱稳定，因此对美洛昔康原料药分别进行高温，光照，过氧化氢溶液氧化的破坏性试验，然后进样分析杂质B的含量，结果显示，在高温，光照下杂质B含量有少量提高，氧化破坏下杂质B含量提高了几十倍，破坏性试验验证了杂质B也是美洛昔康的降解产物。

3.4 杂质A和B的限度

杂质A和B未有完整的毒性毒理研究报告，通过资料文献仅了解二者都是吸入有毒，杂质B对皮肤，粘膜有刺激作用，对眼睛刺激强烈，但可以排除基因杂质的可能性。参考化学药物杂质研究技术指导原则和ICH相关规定，同时结合美国药典USP43-NF38和欧洲药典EP10.0中美洛昔康原料药有关物质的质量规定 ，建议将杂质A和B的限度均定为0.1%。

4 结 语

随着科技的进步，药品质量也在逐步提高。药品质量的提高关键在有关物质，对药物有关物质中各类杂质的控制，显著的影响着药物的安全和质量。现如今，中国药典中多数药物还是采用主成分稀释自身对照法，对单个和杂质总量进行控制，这么笼统的控制是不够的，每个杂质的毒性，危害性不尽相同，我们需要对不同的杂质进行系统分析，进而做出单独的限度控制。在杂质分析领域，LC-MS/MS有着专属性强，灵敏度高，精密度高，检测迅速等诸多优点，还避免了样品复杂的前处理过程，已成为药品中微量杂质分析的首选技术。方法学验证结果证明，该方法可以有效的对杂质A和B进行定性定量分析，为美洛昔康有关物质的质量提高提供参考。