“废弃”胚胎继续囊胚培养及其妊娠结局分析

范丽娟，施文浩，文雯，梁思瑞，陈琰睿，赵皖秋，孟彬，赵静，周寒鹰*

(1.西北妇女儿童医院生殖中心，西安 710003；2.陕西省妇科疾病临床医学研究中心，西安 710003；3.西安医学院，西安 710021；4.西安市第四医院生殖中心，西安 710005)

胚胎形态学评分是目前使用最广泛的评估胚胎发育潜能的方法。胚胎培养第3天(D3)评分为Ⅳ级和F级胚胎被认为是发育潜能差的“废弃”胚胎[1-2]。接受体外受精-胚胎移植(IVF-ET)治疗的患者中有约6.3%的患者因未形成可利用胚胎不得不取消周期[3]。IVF-ET治疗费用较高，无可移植胚胎可能对患者造成较重的经济和心理负担。

胚胎形态学评分有一定局限性，其受主观因素影响较大，因其对早期胚胎的动态发育过程关注较少，导致对早期胚胎发育潜能的预测可能存在缺陷。有文献报道，即使“废弃”胚胎亦有一定的利用价值，其囊胚形成率为17.45%～36.79%，优质囊胚形成率为9.38%～10.38%[4-5]。由“废弃”胚胎养成的囊胚移植后有可能获得临床妊娠并分娩正常新生儿[4]。试管婴儿作为非自然状态下受孕出生的婴儿，其健康问题受到广泛关注。本研究回顾性分析“废弃”胚胎行囊胚“试培养”及移植后的妊娠结局，以期探讨“废弃”胚胎行囊胚“试培养”的临床价值。

资料与方法

一、研究对象

回顾性分析2015年1月至2020年1月于西北妇女儿童医院生殖中心行第1次IVF/ICSI-ET治疗患者的临床资料。

纳入标准：(1)IVF或ICSI授精后双原核(2PN)率≥50%；(2)因所有卵裂期胚胎均为Ⅳ级或F级而行囊胚“试培养”。

排除标准：(1)女方合并存在子宫畸形、输卵管积液及子宫内膜异位症等影响胚胎移植结局的疾病；(2)行胚胎植入前遗传学检测(PGT)的患者。

本研究共纳入246例患者，根据囊胚“试培养”结局不同分为成功组(54例)和失败组(192例)，比较两组患者的基础资料及获卵情况；同时，将成功形成囊胚并移植的患者根据其移植周期不同分为新鲜移植组(41例)和冻融移植组(10例)，观察两组患者的妊娠结局。

二、研究方法

1.胚胎评分与囊胚培养：患者促排卵后，当2/3以上优势卵泡直径发育至17 mm时使用重组HCG(默克雪兰诺，意大利)或人源HCG(珠海丽珠)进行扳机。34～36 h后，在阴道B超引导下行经阴道穿刺负压抽吸取卵术。女方取卵当日，男方取精，根据不同精液参数标准，选择IVF或ICSI授精。授精后16～18 h对胚胎的PN数目进行观察及评分。D3观察卵裂期胚胎培养情况并进行分级评分。卵裂期胚胎评分标准如下：胚胎分为5级：Ⅰ级：8～10细胞，卵裂球均匀，胞质均匀透亮，透明带完整，胚胎无碎片或有少量(<10%)碎片；Ⅱ级：6～7细胞或>10细胞，卵裂球稍不均，碎片10%～20%，透明带完整；Ⅲ级：4～5细胞，卵裂球稍不均，碎片20%～50%，透明带完整；Ⅳ级：碎片>50%，卵裂球不均；F级：无明显卵裂球存在，观察到大量无核碎片。本研究中所有患者的卵裂期胚胎评分均为Ⅳ级或F级，应患者要求并知情同意后将“废弃”胚胎行囊胚培养(培养液G-serious，Vitrolife，瑞典)。囊胚评级参照Gardner囊胚分级法，将D5评分在3CC以上的囊胚定义为可利用囊胚，≥3BB定义为优质囊胚。

2.囊胚移植与黄体支持：囊胚移植包括新鲜周期移植和冻融周期移植，取决于患者基础情况、促排卵方案、囊胚情况(按照我中心常规D6囊胚仅行冷冻移植)及自身意愿。每位患者移植囊胚数目为1～2枚。囊胚移植后每日用黄体酮凝胶(雪诺同，德国)90 mg阴道给药或黄体酮软胶囊(安琪坦，法国)0.6 g阴道给药，同时每日口服地屈孕酮(雅培，美国)20 mg。囊胚移植后第12天测血HCG，若阳性则于移植后第26天行盆腔超声。B超下见孕囊者为临床妊娠；仅HCG阳性而后期B超未见孕囊者为生化妊娠。孕11周停止黄体支持。

3.观察指标及计算方法：主要观察指标为囊胚形成率和活产率；次要观察指标包括优质囊胚形成率、HCG阳性率、临床妊娠率、流产率及早产率。其中：囊胚形成率=形成可利用囊胚数/行囊胚培养卵裂期胚胎数×100%；活产率=活产周期数/移植周期数×100%；优质囊胚形成率=形成优质囊胚数/行囊胚培养卵裂期胚胎数×100%；HCG阳性率=HCG阳性周期数/移植周期数×100%；临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植周期数×100%；流产率=流产周期数/临床妊娠周期数×100%；早产率=早产周期数/活产周期数×100%。

三、统计学分析

结 果

一、2PN“废弃”胚胎囊胚培养情况

本研究共纳入患者246人，共246个周期；D3均无可移植胚胎，将2PN“废弃”胚胎行囊胚培养后，54个周期(54人)获得可利用囊胚：684枚2PN“废弃”胚胎培养形成囊胚65枚，囊胚形成率9.50%；其中优质囊胚40枚，优质囊胚形成率为5.85%。

二、“试培养”成功组与失败组患者基础资料及获卵情况比较

如表1所示，“试培养”成功组与失败组的女方年龄、体质量指数(BMI)、不孕时间、不孕因素分类占比、基础激素水平(FSH、LH)、基础窦卵泡数(AFC)及获卵数比较均无统计学差异(P>0.05)。“试培养”成功组原发性不孕占比为57.41%，显著低于“试培养”失败组(74.48%)(P<0.05)。

表1 “试培养”成功组和失败组基础资料及获卵情况比较

三、“试培养”形成囊胚后不同移植周期的妊娠情况

54例患者获得囊胚后，41例患者行新鲜周期囊胚移植(新鲜移植组)，13例患者因基础情况、促排卵方案和自身意愿取消新鲜周期移植，囊胚冷冻保存备用。新鲜移植组的41例患者中22例患者HCG阳性，且均获得临床妊娠，临床妊娠率为53.66%。2例孕12周前自然流产。仅1例患者孕36周早产，余临床妊娠患者均足月产。新鲜周期移植活产率为48.78%。活产25例新生儿均未发现出生缺陷(表2)。

截至2020年1月，共11例患者行囊胚复苏，其中1例患者囊胚复苏失败未移植，余10例患者囊胚复苏成功，行冻融囊胚移植(冻融移植组)，其中2位患者1次冻融移植2枚囊胚。在复苏的12枚囊胚中8枚为D6囊胚。7例患者HCG阳性，其中2例生化妊娠，5例临床妊娠。3例患者孕2月余自然流产。最终2例患者足月分娩新生儿，均未发现出生缺陷(表2)。因本研究目的不涉及“废弃”胚胎试培养后不同移植周期的优劣，故仅对此部分资料进行描述，并未进行组间比较。

表2 “试培养”形成囊胚后不同移植周期的妊娠情况

讨 论

临床工作中，被常规评价视为“废弃”胚胎的一般包括两类：异常受精的胚胎和胚胎评分极低的2PN胚胎[4]。本研究仅选用授精后16～18 h观察到胚胎内存在明确的2PN及2个极体(PB)的“废弃”胚胎行囊胚培养。部分1PN和0PN(2PB)胚胎可能是因为错过了最佳观察时机，被误认为是异常受精，有文献报道0PN和1PN胚胎的囊胚形成率分别为30.03%和17.09%[6]，但其整倍体率低，不建议移植[7]。

既往研究认为高龄女性AFC、获卵数少、因胚胎因素引起的周期取消率高[8]。本研究所纳入246例“试培养”患者平均年龄(31.31±4.57)岁，“试培养”成功组和失败组平均年龄分别为(31.06±4.03)岁和(31.38±4.67)岁，无统计学差异(P<0.05)。本研究结果未发现年龄是“试培养”失败的危险因素。“试培养”失败组原发性不孕占比74.48%，显著高于“试培养”成功组。这可能与原发性不孕患者存在更高的胚胎发育阻滞和卵子异常等风险相关[9-10]。

本研究中2PN“废弃”胚胎囊胚形成率为9.50%，低于余柯达等[4]报道的17.45%和王治鸿等[5]报道的36.79%；优质囊胚形成率为5.85%，低于余柯达等[4]报道的9.38%和王治鸿等[5]报道的10.38%，原因可能包括两方面：第一，胚胎形态学评分受主观因素影响；第二，本研究仅纳入2PN胚胎，而其它研究纳入了0PN和1PN胚胎，0PN和1PN胚胎可能只是错过了最佳观察时间导致误判，但其仍具有发育潜能。

本研究中41例患者行新鲜周期囊胚移植，移植后妊娠率为53.66%，活产率为48.78%，与本中心常规IVF-ET妊娠率和活产率[11]接近。11例患者行冻融囊胚移植，1例患者因解冻1枚囊胚复苏失败而取消移植。由2PN“废弃”胚胎继续囊胚培养后所获得囊胚解冻复苏成功率为92.31%，低于我中心平均囊胚解冻复苏成功率[12]。10例患者行冻融移植后临床妊娠率为50.00%，但自然流产率为60.00%(3/5)，导致最终活产率仅为20.00%(2/10)。根据现有研究，冻融移植并不增加自然流产风险[13]。10例行冻融囊胚移植的患者中，7例患者移植D6囊胚，仅3例患者移植D5囊胚。本中心前期研究结果显示，D6囊胚整倍体率低于D5囊胚[14]。因此我们认为，本研究中冻融移植周期流产率高一方面可能是由于D6囊胚占比高所致，另一方面可能是由于回顾性研究样本选择性偏倚所致。

辅助生殖技术的子代安全性一直受到关注[15]。虽然本研究中所移植的囊胚均来自“废弃”胚胎，但子代均未出现出生缺陷。提示来自“废弃”胚胎所形成的囊胚移植后子代安全性尚可，利用2PN“废弃”胚胎继续培养囊胚后移植，不失为D3无可移植胚胎患者一种补救的治疗方法。

综上所述，本研究结果显示，D3评分未达标的“废弃”卵裂期胚胎经过“试培养”后有9.5%的囊胚形成率以及新鲜周期移植后53.66%的妊娠率。提示常规的D3卵裂期评分存在一定的主观局限性，可能对一小部分胚胎进行误判。因此，临床上对于D3无可移植胚胎的患者，利用“废弃”胚胎行囊胚“试培养”不失为一种补救治疗的方法，但其安全性和有效性尚需要大样本随机对照研究加以证实。