太原地区910例孕妇脊髓性肌萎缩症携带者筛查及一例家系验证

邓洋，郭进升，张眉花

(太原市妇幼保健院妇科，太原 030012)

脊髓性肌萎缩症(Spinal muscular atrophy，SMA)是以脊髓前角细胞为主的变性以及α-运动神经元的进行性死亡引起的一种常染色体隐性遗传疾病，表现为进行性、对称性、肢体近端为主的肌张力减退、肌无力、肌萎缩。传统观念认为该病仅累及下运动神经元，近年来，越来越多研究表明SMA是一种多系统受累疾病，主要包括心血管、消化、代谢、内分泌等系统，严重时可以导致患者呼吸衰竭、死亡，位居2岁以下儿童致死遗传病的首位[1]。SMA具有种族差异性，欧美人群中SMA的发病率为1/6 000～10 000，携带者频率为1/40～1/50[2]，中国台湾地区人群发病率为1/9 000[3]，目前统计到的中国人群SMA携带率为1/42，但暂无确切的SMA发病率数据[4-5]。

SMA致病基因为运动神经元存活基因1(SMN1)基因，与其高度同源的SMN2基因为疾病修饰基因。所有SMA患者均存在SMN1双等位基因突变，突变形式主要为第7或第7、8外显子纯合缺失突变，约占95%，剩余5%的SMA患者保留了一份SMN1基因突变，如错义突变、小插入、缺失和剪接突变等[6-7]。

减少出生缺陷是我国“健康中国2030”规划中的重要组成部分[8]。数据显示，我国出生缺陷率约为5.6%，因我国人口基数大，每年出生缺陷新增病例高达约90万例[9]。在SMA阳性病例家庭中，生育下一胎再发SMA的风险为25%，并且男孩和女孩患病风险均等。由于SMA的基因突变情况复杂，产前诊断前必须先进行先证者及父母的预分析，明确先证者的SMN1突变类型，再制定在该家系中实行的产前诊断途径和策略，对于减少SMA患儿的出生具有重要价值[4]。因此本研究应用荧光定量PCR技术检测太原市910例孕妇的SMN1基因第7外显子和第8外显子拷贝数变异情况，明确太原地区部分人群的SMA携带率；并应用多重连接探针扩增技术(MLPA)验证SMA阳性家系，为其提供遗传咨询和生育指导，评估出生患儿的遗传风险，以降低SMA患儿的出生率。

资料与方法

一、研究对象

收集2020年1月至2021年4月在我院就诊的孕妇为研究对象，共910例，对其进行SMA携带者筛查。纳入标准：无SMA临床表现，无其他神经肌肉系统疾病，年龄在18～45岁，孕周<21周，身心健康，无心血管、内分泌系统及其他重要脏器的妊娠合并症。本研究通过本院医学伦理审查委员会评审批准，所有研究对象检测前均充分知情同意并签署知情同意书。

二、研究方法

1.样本取材及检测指标：所有受检者提供外周血样本，夫妻双方均为携带者的受检者提供绒毛/羊水穿刺样本。SMA携带的孕妇，对其丈夫进行SMN1基因检测。对明确SMA的患者进行家系验证，并对高风险胎儿进行产前诊断。

2.外周血采集：采集研究对象外周静脉血2 ml，用于提取血液基因组DNA。

3.绒毛穿刺样本：对怀孕10～12周孕妇进行腹壁绒毛活检术获取其绒毛组织。

4.基因组DNA提取：通过磁珠DNA提取方法提取外周血样本中的基因组DNA：使用天隆NP968核酸提取仪以及天隆核酸提取试剂进行DNA提取；应用组织DNA提取试剂盒(easyPureGenomic DNA Kit，EE101-11)提取绒毛穿刺样本中的绒毛组织DNA。提取的基因组DNA用Nanodrop 2000仪(Thermo Fisher Scientific，美国)进行纯度和浓度分析，并按照实验检测要求稀释样本，获得合格的用于检测的DNA样本。

5.实时荧光定量PCR检测：本研究应用SMN1外显子缺失检测试剂盒(上海五色石医学)对提取到的基因组DNA进行SMN1基因第7/8外显子扩增并对拷贝数进行相对定量检测，同时采用化学阻断方法控制SMN2对检测结果的影响。按照试剂盒套组说明书操作：取出试剂盒，将试剂盒组分平衡至室温，根据当次实验所进行的反应数(标本DNA、1个空白对照、1个缺失对照及3个梯度正常对照)计算并移取相应试剂，按照试剂盒方案配制反应体系，按照以下条件进行PCR 扩增：95℃，10 min；95℃，15 s；58℃退火与延伸40个循环，实时收集荧光信号，记录并计算实验结果。

6.MLPA检测：使用MLPA P060试剂盒(SALSA MLPA Kit P060-B2，MRC-Holland，荷兰)对提取的绒毛组织基因组DNA样本进行实验，验证SMN1基因拷贝数变异。按照MLPA试剂盒检测流程进行操作：DNA变性与探针杂交；连接反应；扩增。PCR扩增产物分析采用ABI 3500xl毛细管电泳仪(Thermo Fisher Scientific，美国)，得到的数据用Coffalyser V8.0软件分析。

结 果

一、910例孕妇SMA携带者筛查

纳入的910例孕妇，年龄20～42岁，平均年龄(29.43±3.66)岁，孕周11～20周，平均孕周(16.00±2.47)周。进行荧光定量PCR检测显示，有20例孕妇SMN1基因7、8号外显子杂合缺失，890例孕妇SMN1基因7、8号外显子无缺失(荧光定量PCR扩增曲线如图1示)。提示太原地区我院孕产妇人群中携带者频率为1∶46，即人群每46例中有1例SMA携带者。对20例携带者进行遗传咨询后，其配偶都自愿接受SMA筛查，最终有3对夫妇均为SMA携带者，其中有1对不配合后续检测，另外2对完善相关检测结果显示：1对夫妇育有1例SMA患儿，并且二胎胎儿进行产前诊断为SMN1基因7、8号外显子杂合缺失，SMN2基因7、8号外显子杂合重复，即SMA携带者；另1对夫妇进行产前诊断，最终提示胎儿为SMN1基因7、8号外显子杂合缺失。

二、MLPA验证SMA携带者家系

本研究纳入1例SMA携带者家系，采用MLPA技术结合毛细管电泳方法，分析先证者(2岁)及其母亲(22岁)、父亲(23岁)、二胎胎儿(胎龄14周)SMA致病基因第7和第8外显子缺失与重复情况。其中先证者母亲为SMN1基因第7和第8外显子杂合缺失，未发现SMN2基因7、8号外显子存在变异；先证者父亲为SMN1基因第7和第8外显子杂合缺失，SMN2基因7、8号外显子重复变异；二胎胎儿为SMN1基因第7和第8外显子杂合缺失，SMN2基因7、8号外显子重复变异。先证者为SMN1基因第7和第8外显子纯合缺失，SMN2基因7、8号外显子重复变异(表1)。

表1 MLPA验证SMA携带者家系SMN1、SMN2基因

先证者SMA患儿临床表型信息显示：其肌张力低、肌力检查不合作，膝腱反射未引出，跟腱反射未引出，病理征未引出，扶立时下肢支撑差；常规肌电图提示神经源性损害，核磁共振平扫显示额前间隙增宽，脑电图发育可疑异常。之前进行0～1神经运动检查结果显示：先证者眼球能追视红球和人脸，眼和头能转动180°；有对声音的反应；没有非对称性紧张性反射(ATNA)；无持续手握拳，有拉坐姿势，俯卧位抬头和手支撑异常；内收肌角角度左加右105°，腘窝角右侧100°，左侧90°，足背屈角右侧角度快和慢均，左侧角度快和慢均；不能独坐30 s，手不能主动抓握，不能主动爬，无侧面支撑反应，无降落伞反应，可以翻身，膝反射正常，立位悬垂反应正常，俯卧位悬垂反应正常。

讨 论

SMA是一种不可治愈的常染色体隐性遗传的运动神经元疾病，对于SMA患者越早诊断，越早开始有效治疗，预后越好。目前反义寡核苷酸药物诺西那生钠(Nusinersen)用于治疗l型、2型SMA，于2019年获得中国国家药品监督管理局(NMPA)正式批准[10-13]。利司扑兰(Risdiplam)通过双位点特异性调控SMN2基因(SMN1同源基因)的剪接，促进保留外显子7，提高功能性SMN蛋白水平[13-14]，在2021年6月由NMPA正式批准用于治疗2月龄及以上SMA患者。随着SMA治疗创新药物的不断出现，通过SMN1基因检测明确病因，对SMA患儿精准治疗具有重要意义。SMN1基因突变目前常用的检测方法有：MLPA、qPCR、PCR/限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)以及变性高效液相色谱(DHPLC)，这些方法不仅可以检测SMN1基因拷贝数变异还可以检测SMN1基因微缺失；高通量测序(NGS)技术用于检测SMN1基因内是否存在点突变、错义突变等其他微小突变[15]。对SMA患儿进行临床表型和SMN1基因拷贝数特点进行分析，将有助于SMA患儿的早期诊断、辅助治疗和遗传咨询，特别是对预防先证者家庭再次生育 SMA患儿具有重要意义。

考虑到一般人群中携带SMA的频率相对较高，美国、以色列等国家已将SMA携带者筛查列为常规筛查项目[16-17]，开展SMA携带者筛查工作是降低出生缺陷发生率的重要方面。目前国内数据尚缺乏SMA发病率的大样本量、多中心、大规模的统计数据，现有部分地区进行了相关统计，如中国台湾地区的SMA携带率约为22‰，中国香港地区约为16‰，上海为19‰，柳州为12‰，江苏为17.3‰[18-19]。本研究统计了太原地区部分人群的SMA携带率为21.98‰，与国内其他地区人群相近。

综上，对于SMA家庭来说，在遗传咨询中进行合理的风险评估是十分必要的，产前诊断预防也是目前减轻疾病负担的重要手段。针对SMA的产前诊断可以快速、准确作出判断，尤其针对有阳性家族史的孕妇采取SMN1基因检测手段可以降低SMA患儿的出生，提高出生人口的质量。