精子DNA碎片指数对不同年龄女性体外受精-胚胎移植妊娠结局的影响

杜超，侯开波，张宁，关小川，刘星池，于月新

(中国人民解放军北部战区总医院生殖医学科，沈阳 110016)

近年来，不孕症患者的数量逐年增加，根据WHO数据显示，约15%有生育需求的夫妇受到不孕症的困扰，其中男性因素约占不孕不育因素的50%[1]。过去很长一段时间内，人们对男性生殖力的评估仍然依赖于传统的精液分析，但仍有约15%的不育男性精液常规结果为正常[2]，这说明单纯分析精子数量和活力并不能全面评估男性生育力。随着研究的深入，精子DNA碎片指数(DFI)逐渐受到关注，有研究认为，DFI对精子受精能力、胚胎形成和发育以及妊娠结局有着重要影响[3-4]；但也有研究认为DFI对于男性生育力评估和辅助生殖结局预测的价值有限[5-6]。因此，本研究在严格控制女方因素的影响后，用精子染色质结构分析(SCSA)法检测精子DFI，观察不同DFI患者的妊娠结局，探讨精子DFI对体外受精-胚胎移植(IVF-ET)妊娠结局的影响。

一、资料与方法

1.研究对象及分组：收集2016年1月至2020年12月于北部战区总医院行IVF-ET治疗的不孕不育夫妇为研究对象，共纳入1 079个取卵周期(1 441个移植周期)。纳入标准：(1)夫妻双方染色体检查均正常；(2)男方于助孕前3个月内行DFI检查；(3)女方促排卵方案为长方案或改良长方案。排除标准：(1)男方存在严重的少精子症；(2)女方存在子宫畸形、宫腔粘连、内膜过薄等不利胚胎着床因素；(3)女方存在严重的甲亢、甲减、糖尿病等内分泌疾病；(4)女方存在多囊卵巢综合征(PCOS)或卵巢功能减退等；(5)未随访至最终妊娠结局者。

根据DFI值将患者分为3组：A组：DFI≤15%(精子DNA完整性好)，共845个周期；B组：15%

2.精子DFI检测：DFI的有效检测方法主要有SCSA、单细胞凝胶电泳(SCGE)试验和精子染色质扩散(SCD)试验等[7]。本研究采用敏感性和特异性良好，并且具有高度可比性的SCSA方法进行DFI检测[8]。使用美国BD公司的流式细胞仪，检测试剂盒为精子核完整性染色试剂盒(浙江星博生物)，严格按照产品说明书进行操作。

3.促排卵及IVF：促排卵方案采用标准长方案或改良长方案，期间超声监测卵泡发育情况，待卵泡发育成熟后肌肉注射HCG(珠海丽珠)，36 h后B超引导下取卵。将男性精液采用上游法和密度梯度离心法进行优化处理后行IVF，受精16～18 h后观察受精情况，常规胚胎培养。胚胎培养第3天(D3)观察胚胎质量。D3胚胎评分标准参照卵裂期胚胎评分标准[9]：D2细胞数为2～4，D3细胞数为7～9，细胞大小相对均匀、形态相对规则、碎片<25%为优质胚胎。视胚胎发育情况决定是否行囊胚培养，囊胚评分参照Gardner评分[10]：滋养外胚层细胞及内细胞团评分均为A或B的囊胚为优质囊胚，有任一者评分为C的囊胚为非优质囊胚，两者评分均为C的囊胚为不可利用囊胚。

4.胚胎移植及妊娠判断：根据患者情况选择新鲜胚胎移植或冻融胚胎移植，移植后行黄体支持。胚胎移植14 d后随访患者血HCG值，移植28 d后行超声检查，如宫腔内监测到孕囊及胎心，定义为临床妊娠并记录着床胚胎数，随访至妊娠结束。

5.观察指标及判断标准：正常受精率=正常受精卵数/受精卵总数×100%；D3优质胚胎率=优质胚胎数/正常受精数×100%；囊胚形成率=囊胚形成数/囊胚培养数×100%；优质囊胚率=优质囊胚数/囊胚培养数×100%；种植率=着床胚胎数/移植胚胎数×100%；临床妊娠率=临床妊娠周期数/所有移植周期数×100%；活产率=活产周期/所有移植周期数×100%。

二、结果

1.不同DFI组患者的基本资料比较：3组患者除C组男、女方年龄显著高于A组(P<0.05)外，其余指标如女方体质量指数(BMI)、基础FSH(bFSH)、抗苗勒管激素(AMH)、基础窦卵泡数(AFC)等均无显著性差异(P>0.05)(表1)。

表1 不同DFI组患者基本资料比较

2.取卵周期中不同年龄各DFI组患者受精及胚胎发育情况比较：为尽力消除男、女方年龄对妊娠结局的干扰，将3组患者按照女方年龄分为<35岁和≥35岁进行分层分析。<35岁患者中，B、C组的优质囊胚率显著低于A组(P<0.05)，3组间的正常受精率和优质胚胎率无显著性差异(P>0.05)，囊胚形成率随DFI升高有降低趋势，但尚无显著性差异(P>0.05)。≥35岁患者中，C组患者正常受精率显著低于A、B组(P<0.05)，3组患者优质胚胎率无显著性差异(P>0.05)，囊胚形成率和优质囊胚率随DFI升高有下降趋势，但尚无显著性差异(P>0.05)(表2)。

表2 取卵周期中不同年龄各DFI组胚胎发育及受精情况比较(%)

3.移植周期中不同DFI组胚胎移植情况及不同年龄各DFI组妊娠结局比较：1 079个取卵周期共进行了1 441次胚胎移植(A组1 114个周期，B组281个周期和C组46个周期)。为了更加准确地分析不同DFI组患者胚胎移植后的妊娠结局，对患者移植周期的女方年龄、平均移植胚胎数和移植日子宫内膜厚度进行比较，3组间均无显著性差异(P>0.05)(表3)。不同年龄各DFI组妊娠结局比较，A组患者种植率、临床妊娠率和活产率均有高于其余两组的趋势，但尚无显著性差异(P>0.05)(表4)。

表3 移植周期中不同DFI组患者胚胎移植情况比较

表4 不同年龄各DFI组妊娠结局比较(%)

三、讨论

近年来，男性因素在辅助生殖中的作用越来越受到人们的重视。精子非整倍体、表观遗传学特征、精蛋白及组蛋白等因素都可能影响胚胎质量甚至妊娠结局[11]，精子DFI被认为是一种评估男性生育力的有力指标[12]。但精子DFI检测方法众多，加之研究人群和方法不尽相同，针对DFI的具体影响仍然存在争论。本研究将患者按照不同DFI进行分组，比较各组间妊娠结局的差异，探讨DFI对于辅助生殖结局的影响。

研究结果显示，当女方年龄≥35岁时，DFI增加会显著降低患者的正常受精率，提示在高龄患者中，DFI过高可能影响精子的受精能力。有研究表明，精子DFI与精子活力和形态存在一定相关性，这可能是导致其受精能力降低的主要原因[13]。3组的优质胚胎率并无显著性差异(P>0.05)。随着精子DFI升高，囊胚形成率和优质囊胚率有下降趋势，但尚无统计学差异(P>0.05)，这可能与样本量相对不足有关，有待后续进一步扩大样本量的研究。对于年龄<35岁的患者，精子DFI的升高并不会降低患者的正常受精率，但行囊胚培养时，DFI≤15%组患者的优质囊胚率显著高于15%

本研究对患者移植周期的妊娠结局进行比较发现，不同年龄段的女性各DFI组的种植率、临床妊娠率和活产率并无显著性差异(P>0.05)，提示在移植周期中，DFI的增加对患者最终妊娠结局无明显影响。既往研究认为，配偶精子DFI数值高的女性复发性流产率显著高于其配偶精子DFI数值较低者(P<0.05)[17]。但近年来也有研究得出不同结论[18-19]，Brahem等[20]发现经过密度梯度洗涤和上游处理后的精子DFI会显著降低；王青欣等[21]则认为处理后的精子在DFI和活力方面均得到明显改善，因此洗涤前的精子DFI检测价值有限。另外，女性卵泡的修复作用不容忽视，卵母细胞能够在整个卵子发生过程中修复DNA损伤，并提供基因产物，负责修复受精后两个亲本基因组的DNA损伤[22-23]。因此，在多种复杂因素的作用下，精子DFI对最终妊娠结局的直接影响较为有限。

综上所述，本研究通过比较不同DFI患者IVF的妊娠结局发现，虽然DFI对患者IVF-ET妊娠结局存在一定的影响，但其对临床妊娠率和活产率等的影响较为有限。目前关于精子DFI 对IVF-ET妊娠结局的影响仍难有定论，需要多中心、更大样本量的前瞻性研究加以探讨。