青稞根腐病生防放线菌的筛选及防效研究

李雪萍，徐冬丽，刘梅金，许世洋，王国平，郭建炜，李建军，李敏权

(1.甘肃省农业科学院植物保护研究所，甘肃兰州 730070；2.甘肃甘南州农业科学研究所，甘肃合作 747000； 3.甘肃农业大学草业学院，甘肃兰州 730070)

青稞(L. var. nudum Hook.f.)是我国藏区人民的主食，对藏区的发展和稳定作用重大。在西北青藏高原地区，青稞根腐病的发病率达5%～20%，严重影响青稞的生产。目前，有关青稞根腐病的研究较少。关于青稞根腐病的防治，在国外，主要通过选育抗禾谷镰孢的大麦品系及采用化学药剂与木霉素结合的方法进行；在国内，辛忠民等开展了筛选化学药剂进行防治的研究。抗性品种选育难度大，化学防治易引起病原菌产生抗药性，且容易造成环境污染等负面效应。因此，生物防治成为了研究热点。

目前，针对由镰孢菌引起的根腐病已发现了多种有良好防效的生防真菌，如哈茨木霉和康宁木霉对由尖镰孢、半裸镰孢、燕麦镰孢和腐皮镰孢引起的苜蓿根腐病有良好的防效；灰黄青霉和土曲霉对由镰孢菌引起的草莓根腐病防效较好；淡紫青霉对尖镰孢菌抑制作用较强；可减轻由镰孢菌属引起的土传病害。在生防细菌方面，贝莱斯芽孢杆菌对大豆根腐病、马铃薯枯萎病以及由立枯丝核菌、腐皮镰孢、尖镰孢和链格孢引起的番茄根腐病防效良好；枯草芽孢杆菌对由镰孢菌引起的黄芪根腐病防效较好。在生防放线菌方面，以链霉菌属为主的生防菌株对镰孢菌的抑制效果较强，如浑圆链霉菌、黄链霉菌、微白黄链霉菌等。然而，在青稞根腐病生物防治方面，仅有岳海梅等发现球毛壳菌对青稞全蚀病和根腐病有良好的防效，在生防细菌方面仍为空白。鉴于此，本研究采集健康青稞植株及其根际土壤，以期从中筛选出对青稞根腐病有良好防效的放线菌，为青稞根腐病的生物防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品的采集

采用多点采样法在甘肃省甘南藏族自治州合作市、卓尼县、临潭县等地采集青稞健康植株及其根际土壤各35份，装入放有冰袋的保温盒中，待用。

1.2 根部放线菌的分离

将健康青稞植株根部土壤冲洗干净、晾干；在超净工作台中，剪下青稞根部放入装有70%酒精的小烧杯中2～3 s；放入0.1%的升汞溶液中消毒10 s；用无菌水冲洗4次，放在已灭菌的滤纸上吸干水分；用无菌解剖刀将根段两端切去，剩余根段接于高氏一号平板之上，每皿上均匀接三段根；在28 ℃恒温培养箱约15～30 d后，在根段附近挑单菌落转移到另一高氏一号平板之上，所得菌株即为放线菌。

1.3 土壤中放线菌的分离

取10 g从健康青稞植株根部抖下的土壤，装入盛有100 mL无菌水的三角瓶中，在振荡机上振荡10 min；将振荡后的土壤悬液稀释到10，用无菌移液枪吸取50 μL于高氏一号平板之上，立即用涂布器涂抹均匀；在28 ℃恒温培养箱中培养5～7 d后，挑单菌落转移至另一高氏一号平板，所得菌落即为放线菌。

1.4 菌株纯化

将分离得到的放线菌菌株采用平板划线法纯化，观察其菌落形态及显微形态，2～3次后纯化，然后在PDA培养基繁殖备用。

1.5 拮抗放线菌菌株初筛

采用平板对峙法在PDA培养基上进行，即用直径为2.5 mm的打孔器打取平板培养的供试病原木贼镰孢菌，接种于直径为9 cm的PDA平板正中心；将待测放线菌等距离点接4次于距病原菌边缘2 cm处，每株放线菌5组重复，25 ℃恒温培养7 d后，测量抑菌圈。

1.6 拮抗放线菌复筛

对初筛得到的平均抑菌圈大于20 mm的放线菌用发酵液法进行复筛，即将菌株接种于装有200 mL培养液(马铃薯∶葡萄糖=10∶1)的500 mL的三角瓶中，每株菌3个重复，在28 ℃、150 r·min的摇床中振荡培养5 d；将培养液装入离心管中，10 000 r·min离心10 min；将上清液过0.22 μm的微孔滤膜，取1 mL滤液于预先制备好的PDA平板上，用涂布器涂抹均匀，3个重复，制成带毒平板；用无菌打孔器取供试病原菌接种于带毒平板中央，以未带毒的平板接种供试病原菌作为对照；25 ℃恒温培养5 d，测量供试病原菌的菌落直径，计算生长抑制率。

生长抑制率(%)=(对照平板病原菌菌落直径-带毒平板病原菌菌落直径)/(对照平板菌落直径-接入菌饼直径)×100%

1.7 拮抗放线菌生防效果测定

采用盆栽法进行防效测定，对生长10 d的青稞植株进行接菌处理，分别为接入40 mL无菌水(阴性对照，CK1)，接入病原菌悬液20 mL+无菌水20 mL(阳性对照，CK2)，接病原菌悬液20 mL+筛选出的拮抗放线菌菌悬液20 mL(EG)，统计其发病率，计算病情指数和防效，防效=(对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病情指数×100%。

1.8 生防放线菌的鉴定

DNA提取采用OMEGA细菌试剂盒按其说明书进行。PCR扩增采用细菌的通用引物进行：27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R:5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。反应体系为25 μL，包括 DNA模板1.0 μL，10×Buffer(含2.5 mM Mg) 2.5 μL，Taq 聚合酶(5 U·μL) 0.5 μL，dNTP(10 mM)1.0 μL，Primer(±10 μM) 1 μL，ddHO补至25 μL；轻弹混匀，瞬时离心收集管壁上的液滴至管底。反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸80 s，35个循环；72 ℃下延伸 7 min，4 ℃保存。反应完成后，取2 μL PCR 产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR 产物用AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒按说明书进行。将纯化后的PCR 产物送于北京天一辉远生物科技有限公司进行测序。使用的测序仪为ABI3730-XL。参照李雪萍等方法比对测定序列并构建系统发育树。

1.9 数据处理与分析

基因序列采用CLUSTALX1.83、MEGA7处理；数据用Excel 2007和 DPS 15.10处理，用Duncan新复极差法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 拮抗放线菌的筛选

从供试青稞的根及其根际土壤中共分离得到放线菌47株，经过初筛得到16株抑菌圈大于20 mm的菌株(图1)。

图1 部分放线菌与病原菌拮抗效果Fig.1 Antagonistic effect of part actinomycetes and pathogen

初筛得到的NH4-1等16株菌抑菌效果如图2所示。复筛时的生长抑制率如表1所示，其中，AP11和H35-1两株菌的抑制率最高，分别为80%和71.26%，二者间差异显著，且显著高于其他菌株，其他各菌株的生长抑制率均低于60%。

图2 放线菌抑制效果Fig.2 Inhibition effect of actinomycetes

表1 各放线菌对病原菌的生长抑制率Table 1 Growth inhibition rate of each actinomycetes to pathogen

2.2 拮抗放线菌的防效

对病原菌生长抑制率较高的两株菌H35-1和AP11进行防效测定，结果(表2)发现， H35-1与AP11均对青稞根腐病防效良好，各处理间发病率、病情指数及防效均差异显著，其中H35-1的防效为30.74%，AP11的防效为48.31%，使根腐病的病情指数降低50%左右。

表2 两株放线菌的防效Table 2 Control effect of the two actinomycetes

2.3 拮抗放线菌的鉴定

对菌株AP11进行分子鉴定，系统发育树如图3所示，与酸疮痂链霉菌()的遗传距离为零，自展支持率为100，鉴定其为酸疮痂链霉菌。

图3 基于16S rDNA序列的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence

3 讨 论

3.1 拮抗放线菌的筛选

定殖在植株体内及根际土壤中的放线菌是宝贵的生物防治资源，其能够抑制靶标病原物的生长从而起到防治植物病害的作用。本研究中采用平板对峙法从青稞植株及根际土壤中初筛得到47株对青稞镰孢根腐病病原具有拮抗作用的放线菌，不同菌株抑制病原菌生长的作用效果不一。

目前国内仍缺乏对菌株拮抗效果的评定标准，仅有杨 蕾等、张 瑾等对拮抗菌株的拮抗效果进行了初步的分级，故本研究根据初筛结果共挑选16株抑菌圈大于20 mm的菌株进行复筛，结果发现，各放线菌对病原菌的生长抑制率与初筛拮抗效果一致，这与曾文婷等、李 威等的研究结果相似。但是部分初筛效果较好的菌株经复筛后其抑菌效果一般，这可能与其产生的抑菌活性物质种类、代谢物质种类和量的不同有关，具体原因还需进一步研究。

3.2 拮抗放线菌的防效

本研究对拮抗性能较好的菌株H35-1和AP11进行防效测定，结果发现，两株放线菌对青稞镰孢根腐病的防效良好，与复筛结果一致，说明其产生的活性物质稳定性良好。但在田间应用中，土壤环境因子复杂，菌株还会受微生物间相互作用及植物与根际微生物间关系的影响，如赖宝春等研究发现，盆栽防效良好的单一菌剂在田间试验中效果并不明显。因此，其防效需要进一步田间实施验证。

生防菌的防病性不仅与其本身相关，还可以通过对培养基质和发酵条件优化等途径进行提高，如梁春浩等通过对放线菌门暗黑链霉菌的培养基质和发酵条件进行优化后，发现其对番茄叶霉病的抑菌活性显著提高。大量研究表明，复合菌剂处理可显著降低发病率，对植物病害有较高的防效。因此，本研究对所筛选具有良好防效菌株的发酵条件及复合配比等有待进一步研究。链霉菌属的多数菌株是良好的生防菌资源，具有生防广谱性，本研究对所筛选的高效防病菌株AP11鉴定发现，其为酸疮痂链霉菌，属链霉菌属且防效较好，且无致病性，与姚锦爱等、熊仕俊等研究结果一致。但也有研究发现，酸疮痂链霉菌是马铃薯和白萝卜疮痂病的病原，这可能和寄主以及生长环境等因素相关。