千层纸素A动员内皮祖细胞促进血管新生作用机制研究

冷雨泽，张璐莎，孙伟，李梦瑶，薛岳进，陈璐，王虹

外周血管疾病是由于外周动脉血管狭窄或闭塞导致的肢体缺血性疾病，已成为威胁人类健康的主要疾病之一[1]。缺氧是组织缺血后最主要的病理表现，组织缺血缺氧所产生的信号分子可动员骨髓内皮祖细胞（EPCs）至外周循环，并归巢于损伤内皮参与新生血管的形成。Morishita等[2]研究表明，EPCs可分化为成熟内皮细胞，在心肌缺血和血管损伤时，EPCs可诱导血管生成和血管修复。在机体缺血或细胞因子的作用下，EPCs动员到外周循环并归巢至缺血组织，在局部分泌血管新生相关的因子，分化、增殖形成内皮细胞与新生血管，促进内皮损伤修复[3]。激活基质金属蛋白酶9（MMP9）通路可动员骨髓EPCs进入血液循环，以修复血管内皮[4]；肝细胞生长因子（HGF）其刺激有丝分裂、细胞运动和基质侵袭的能力使其在血管生成、肿瘤发生和组织再生中发挥中心作用，能够显著提高EPCs的迁移能力[5]，CXC型趋化因子配体16（CXCL16）及其受体介导EPCs募集和血管形成，EPCs通过分泌单核细胞趋化性蛋白1（MCP-1）提供血管生成环境[6,7]。由于缺血区细胞存活率较低，且EPCs扩增能力及自我更新能力有限，因此如何促进EPCs动员仍需进一步的研究。千层纸素A（又名千层纸黄素，木蝴蝶素），属于次生代谢产物，为黄酮类化合物。本课题组前期研究结果表明，千层纸素A可通过内皮依赖的一氧化氮途径发挥舒张血管的作用[8]，提示千层纸素A可用于外周血管疾病的治疗。证据表明，内皮祖细胞从骨髓动员到外周血液中，迁移到缺血部位发挥促血管新生的作用[9,10]。本研究采用小鼠后下肢缺血模型，通过激光多普勒成像仪（USA）观察到千层纸素A对后下肢缺血损伤小鼠血流具有恢复作用，从而进一步发现千层纸素A可促进后下肢缺血小鼠腓肠肌组织中EPC的动员，最终发现千层纸素A可上调血管新生相关的蛋白或因子基质金属蛋白酶3（MMP-3）、MMP-9、CXCL16、MCP-1、HGF的表达。表明千层纸素A通过促进EPCs动员来改善缺血症状可能与调节血管新生相关蛋白或因子有关，可为治疗缺血性疾病提供临床前证据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物30只SPF级健康ICR小鼠，雄性，体质量（30±2）g，8周龄，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2012-0001。实验动物于天津市中国医学科学院生物医学放射工程研究所动物房中分笼饲养，自由进食，饲养温度22～25℃，相对湿度40%～60%。

1.1.2 药物与试剂千层纸素A，天津中医药大学中医药研究院药学部提供，由中药杜仲中分离提取，经核磁共振（NMR）谱数据分析鉴定；辛伐他汀（杭州默沙东制药有限公司，批号L0233822）；avertin（美国Sigma公司）；流式抗体PE-Flk-1，APC-Cy7-Sca-1（Becton，Dickin-son and Company；货号分别为555308、560654）。实验用水为去离子水。全蛋白提取试剂盒，甘氨酸（glycine），Amresco公司；SDS，Sigma公司；5×SDS上样缓冲液，碧云天公司；Anti-MMP-9 antibody（Cell Signaling公司）；Anti-MMP-3 antibody（Cell Signaling公司）；Anti-beta Actin antibody（美国Abcam公司，货号ab6276）；小鼠肝细胞生长因子检测试剂盒（北京索莱宝公司，货号:SEKM-0089）。

1.1.3 仪器体式显微镜LEICA S8APO（德国Leica公司）；流式细胞仪（美国BD公司）；64R型低温高速离心机（美国Beckman公司）；小动物手术器械包（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；COMPAC5小动物多功能麻醉机（美国VETEQUIP）；纯水系统，美国Millipore公司产品。

1.2 方法

1.2.1 单侧后肢缺血模型（HLI）的建立根据文献方法建立小鼠单侧后肢缺血损伤模型。以15 mg/ml阿佛丁（16.5 ml/kg）腹腔注射行全身麻醉，取仰卧位固定后备皮。自右后肢腹股沟处做横向切口，钝性分离肌肉，暴露股动脉、股静脉和伴行神经，其中股动静脉起源于髂外动脉终止于隐静脉和隐动脉，以7/0号丝线结扎骨深动脉起始处血管，离断并剪掉股动脉及其分支，逐层缝合肌肉和皮肤，左侧后肢作为非缺血肢体对照。术后腹腔注射0.2 ml浓度为5 mg/ml抗生素，防止感染。采用激光多普勒扫描成像系统检测小鼠结扎并离断股动脉前后结扎部位的血流速度，术后血流速度降至术前的10%以下，且血流的频谱发生明显的改变，以此作为后肢缺血模型成功建立的标准，将小鼠置于37 ℃电热毯上直至苏醒。

1.2.2 实验分组及用药按照随机双盲的方法，将后下肢缺血模型造模成功的小鼠分成三组：模型组、千层纸素A组（Oroxylin A）和辛伐他汀组（Sim），每组各10只。为便于分组及观察，在小鼠尾部涂上横条纹，以示不同号码。模型组采用0.2%CMC-Na的生理盐水灌胃；千层纸素A组采用千层纸素A 10 mg/kg·d，灌胃；辛伐他汀组采用辛伐他汀10 mg/kg·d，灌胃。术后1 h给药；模型组给予同体积的0.2%CMC-Na的生理盐水，连续给药3、7、14、28 d。

1.2.3 相关检测方法

1.2.3.1 激光多普勒高分辨点扫描检测小鼠后肢血流灌注为评价各组小鼠结扎肢体血流灌注恢复程度，采用激光多普勒灌注成像仪来测量术前、术后及给药后3、7、14、28 d这6个不同时间点的缺血侧（右侧后肢）的血流灌注情况与未缺血对侧（左侧后肢）的血流灌注。用分析软件（moor LDI laser Doppler Imager Review V 6.0）分析血流灌注情况，通常把背景阈值设置为0.2，以阈值调整去除背景噪音，选择目的检测区域经过软件表示平均的激光多普勒血流值。用每只小鼠同一时间点的缺血侧与未缺血侧的血流灌注情况的比值表示这只小鼠的缺血下肢血流恢复情况。

1.2.3.2 染色法检测缺血小鼠腓肠肌组织形态将各组小鼠的腓肠肌组织，浸入10%多聚甲醛溶液中，备用于组织切片，经脱蜡、切片、脱蜡脱水、清洗、染色等步骤处理后，组织镜检观察标本着色情况。若着色较好，染色核浆分明，红蓝适度，透明洁净，可用中性树胶封片；晾片后可阅片拍照。

1.2.3.3 流式细胞术检测EPCs动员采用FACS流式细胞仪检测单个核细胞悬液，每份标本检测10万个细胞，以GFP+/Flk-1+/Sca-1+细胞占单核细胞的比例表示外周血内皮祖细胞数量，采用Cell Quest软件分析并记录外周血单个核细胞中GFP+/Flk-1+/Sca-1+内皮祖细胞的比例。

1.2.3.4 酶联免疫吸附（ELISA）法检测血管新生相关因子严格按照说明书要求规范操作，采用ELISA法分别测定术后3、7、14 d，小鼠血浆中血管新生相关因子HGF的表达水平，酶标仪检测吸光度值，应用标准曲线计算浓度。

1.2.3.5 蛋白芯片检测血管新生相关蛋白按照蛋白芯片（R＆D公司，货号：ARY028）说明书操作，检测术后3、7、14 d，CXCL16、MCP-1蛋白的变化。

1.2.3.6 蛋白免疫印迹法检测血管新生相关蛋白提取骨髓总蛋白，BCA法测定骨髓组织总蛋白的浓度，分装蛋白样品。通过电泳、转膜、封闭、加入一抗Anti-MMP 9 antibody（1:500）、Anti Anti-MMP 3 antibody（1:500）、-beta Actin antibody（1:5000）孵育，加入对应二抗（1:10000）显色，胶片扫描分析后分析MMP3、MMP9蛋白水平。

1.3 统计学方法采用SPSS 16.0 统计软件进行统计学处理，结果以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用LSD-t法检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 千层纸素A对后下肢缺血损伤小鼠血流恢复作用课题组前期实验中，应用小鼠后下肢缺血模型，发现千层纸素A中剂量（10 mg/kg·d）组较低剂量组和高剂量组效果显著，本研究采用中剂量进一步探讨千层纸素A促血管新生的作用机制。模型组（Model）、千层纸素A组和辛伐他汀组（Sim）小鼠单侧后肢缺血损伤模型术前、术后及术后3、7、14、28 d，采用激光多普勒成像仪测定小鼠下肢血流，激光多普勒成像系统采集小鼠股动脉结扎前、结扎后、给药后1、3、7、14、28 d的血流灌注情况和小鼠股动脉结扎侧与正常侧后肢血流比值动态分析结果图。如图1A所示，与模型组相比，千层纸素A组小鼠下肢血流明显改善，术后14、28 d，与模型组相比，千层纸素A组和辛伐他汀组缺血组织血流恢复显著提高，图1B为量化结果。给药28 d，小鼠腓肠肌组织HE染色结果如图1C所示，后下肢缺血小鼠给予千层纸素A治疗，与模型组相比，肌肉组织形态较规则，肌束间隙明显变小，有较明显的腓肠肌缺血损伤修复作用。结果表明，术后14、28 d，千层纸素A可促进小鼠缺血下肢血流恢复。

图1 千层纸素A对后下肢缺血小鼠血流恢复的影响

2.2 千层纸素A对HLI小鼠腓肠肌组织中EPC动员的影响应用流式细胞术采集小鼠股动脉结扎前后、给药1、3、7 d的外周血中内皮祖细胞数量，外周血中GFP+/Sca-1+/Flk-1+细胞比例动态分析结果见图2，图2 B结果显示，给药1 d，千层纸素A组（3.67±3.03）和假手术组（2.67±1.73）外周血内皮祖细胞比例显著高于模型组（0.88±0.75），P＜0.05。

图2 千层纸素A对后下肢缺血小鼠内皮祖细胞动员的影响

2.3 千层纸素A对HLI小鼠血管新生相关蛋白及HGF因子的影响

2.3.1 千层纸素A对小鼠缺血腓肠肌MMP3，MMP9蛋白表达的影响给药14 d时缺血腓肠肌组织Western blot结果显示（图3），在给药第3 d时与模型组比较，千层纸素A治疗组MMP3、MMP9的表达量均显著下降；给药第14 d时与模型组相比较，千层纸素A组MMP3的表达量呈现显著下降趋势；千层纸素A对后下肢缺血小鼠血浆中HGF因子浓度的影响如图4所示。给药第3 d时与模型组比较，千层纸素A治疗组HGF的浓度显著上升（P＜0.05）。

图3 Western blot检测后下肢缺血小鼠给药3、7、14 d缺血肌肉组织MMP3、MMP9蛋白和血浆HGF因子的表达

2.3.2 千层纸素A对小鼠缺血腓肠肌CXCL16、MCP-1蛋白表达及血浆中HGF因子的影响给药14 d时缺血腓肠肌组织蛋白芯片结果如图4所示，在给药第3 d时与模型组比较，千层纸素A治疗组CXCL16的表达量显著上升（P＜0.001）；给药第14 d时与假手术组相比较，模型组的CXCL16表达量呈现显著上升趋势（P＜0.001）；给药第7 d时与假手术组比较，模型组的MCP-1的表达量显著下降（P＜0.01），千层纸素A组与模型组比较表达量显著上升（P＜0.05）。

图4 蛋白芯片和ELISA检测后下肢缺血小鼠给药14 d缺血肌肉组织CXCL16和MCP-1蛋白的表达

3 讨论

本研究首先通过实验发现千层纸素A对后下肢缺血损伤小鼠具有血流恢复作用，进一步得到千层纸素A可以动员内皮祖细胞促进血管新生，其作用机制可能与促进EPCs动员和血管新生的关键调节蛋白或因子MMP9、CXCL16、HGF、MCP-1有关。内皮祖细胞与缺血性疾病有密切关联，组织缺血缺氧所产生的信号分子可动员骨髓EPCs至外周循环，并归巢于损伤内皮参与新生血管的形成，从而改善后下肢缺血的症状[11]。

内皮祖细胞是血管内皮细胞的前体细胞，具有多向分化潜能，是一类能增殖、分化为血管的内皮细胞，临床价值巨大。在某些生理或病理因素的刺激下，从骨髓动员到外周血参与损伤血管的修复[12]。MMP3、MMP9、CXCL16、HGF、MCP-1是促进EPCs动员和血管新生的关键调节因子。研究显示，间充质干细胞通过产生肝细胞生长因子（HGF）、基质金属蛋白酶MMP-9和MMP-3提供血管生成环境，并在小鼠中与内皮祖细胞共注射时诱导血管形成[13]。

新生血管通过两种机制产生：一是先前存在的微血管内皮细胞的复制和重组；二是重新招募内皮祖细胞，这些内皮祖细胞随后并入现有组织，分化为成熟的功能性内皮细胞[14]。人类和小鼠的内皮祖细胞已被证明可表达CXCL16受体CXCR6[15]，且CXCL16和MCP-1均具有促进血管生成的作用[16]。一定条件下，EPCs可诱导分化为血管内皮细胞，还可分泌大量与血管新生相关的生长因子，作用于自身和体细胞调节血管再生。因此，血管新生相关因子的分泌对于缓解缺血情况，改善缺血性疾病的症状尤为重要。

千层纸素A给药后，外周血中代表内皮祖细胞的GFP+/Sca-1+/Flk-1+细胞数量明显高于模型组，提示千层纸素A通过改善缺血组织微环境来促进骨髓内皮祖细胞的动员。在第7 d时，千层纸素A增加对HLI小鼠腓肠肌组织中血管新生相关因子或蛋白CXCL16，MCP-1的表达，提示千层纸素A可提供更好的血管生成环境，募集EPC,促进血管生成。病理状态下，模型组MMP调节功能下降，不利于内皮细胞迁移功能的发挥，使得血管新生功能降低。而千层纸素A组基质金属蛋白酶MMP3，MMP9蛋白的表达升高，提示千层纸素A可能通过激活MMP-9通路动员骨髓EPCs进入血液循环，修复血管内皮，一定程度上可促进血管新生，缓解下肢缺血。此外，MMP还是一种炎性介质，适当调节MMP表达有利于新生血管的结构与功能的稳定。结果显示，在给药后第3 d，与模型组比较，千层纸素A治疗组HGF的浓度显著上升，提示千层纸素A可能提高了EPCs的迁移能力，使其更好的促进血管生成。

综上可知，千层纸素A能够促进EPCs分泌释放血管新生所必需的因子MMP3、MMP9、CXCL16、HGF、MCP-1，可能是千层纸素A促进EPCs介导的血管新生作用机制之一。然而千层纸素A促进骨髓EPCs动员的机制及其促血管新生的具体过程尚待进一步研究。本研究结果对于千层纸素A用于治疗缺血性疾病提供了实验依据。