基于RhoA/ROCKⅡ通路探讨原发性高血压病与炎性因子相关性研究

薛文静，杨一格，柴若宁，石树青，石晶晶，张雪松，胡元会

炎症与大多数心血管疾病的发生发展密切相关，有学者[1]指出高血压病是一种轻微炎症性疾病，其发生发展与血管炎症有着重要联系。慢性炎症可能是原发性高血压与动脉粥样硬化（AS）相互关联的重要指标。炎症细胞因子是一组小分子多肽由机体的免疫和非免疫细胞合成、分泌，具有广泛的生物学活性，可以调节多种免疫应答和细胞炎症。炎症细胞因子根据其功能可分为两种不同的类别，即促炎性细胞因子和抗炎性细胞因子。与原发性高血压病密切相关的促炎性因子包括超敏C反应蛋白（hs-CRP）、C反应蛋白（CRP）[2]、白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）、白介素-8（IL-8）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）[3]及纤溶酶原激活物抑制剂等。抗炎因子则白介素-10（IL-10）为代表。此外，有研究表明Rho/ROCK可通过改变巨噬细胞表型（M1/M2），介导T辅助细胞释放细胞因子以及在成纤维细胞中介导MRTF/SRF、YAP/TAZ/TEAD、TGF-β等信号通路参与炎症反应[4]。

Rho/ROCK通路与细胞的生长、发育、分化以及迁移密切相关[5]。大量研究表明Rho/ROCK途径与炎症细胞因子相互作用对糖尿病、炎症性疾病、肿瘤、肺损伤、心脏病和神经损伤性疾病发生发展产生了一定的影响[6]，以该通路作为疾病的治疗靶点越来越得到人们的广泛关注[7]，关于药物对该通路的干预研究也越来越多。关于Rho/ROCK对炎症细胞因子影响的研究，目前较集中于几类常见的促炎因子：IL-6、IL-1、TNF-α、TNF-β、单控细胞趋化因子（MCP-1）等。本研究旨在探讨RhoA/ROCK信号通路及相关炎症因子在原发性高血压病中的表达及其与疾病的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象选取广安门医院于2020年8月至2020年12月收治的120例原发性高血压病患者为观察组。并同期纳入本院体检的30例无高血压的健康人群（年龄与高血压病组相当）为对照组。收集年龄、性别、身高、体质指数（BMI）、吸烟史、家族史等一般资料。病史、用药史、血常规、生化检查、血压记录等临床资料。纳入标准：原发性高血压组：符合《中国高血压防治指南2018修订版》[8]原发性高血压病诊断标准；且年龄在30～80岁之间，男女不限，自愿参加并签署知情同意书。健康人组：符合临床认证的健康人诊断标准[9]；且年龄30～80岁，男女不限、自愿参加并签署知情同意书。排除标准：临床相关资料不完整者；妊娠或哺乳期妇女；高血压危象；继发性高血压；合并严重肝肾功能不全；有心、脑严重原发疾病、精神病患者；合并活动性结核病或风湿免疫疾病患者；近2周内使用抗生素、抗感染药物治疗者；近1个月内有感染、发热、创伤、烧伤、手术史和炎症；合并有严重造血系统疾病、恶性肿瘤；过敏体质者。凡符合上述10项中任意一项者即予以排除。

1.2 研究方法患者入院次日空腹采静脉血2 ml，离心机2500 rpm×10 min，提取血清分装至1.5 ml EP管中，-80 ℃保存。采用EDTA抗凝管抽取 5 ml静脉血。先将5 ml人外周血淋巴细胞分离液置入15 ml离心管后将5 ml EDTA抗凝全血缓慢注入外周血淋巴细胞分离液液面上，使血液和分离液间形成清晰的间限。离心机2000 r/m离心20 min。吸取中间层白色絮状物注入新的15 ml离心管，加10 ml PBS后混匀，以2000 r/m离心20 min。弃去上清液，再次用PBS清洗。重复该步骤1～2次后，去上清，加1 ml Trizol并吹打后保存至1.5 ml EP管中，-80 ℃保存。采用酶联免疫吸附法检测ROCKⅡ、NF-κBp65、TIMP-1、ICAM-1表达水平，ELISA试剂盒由上海酶联提供，多功能酶联免疫分析仪由深圳雷杜生命科学股份有限公司提供。并采用PCR检测外周静脉血单核细胞中RhoAmRNA、ROCKⅡmRNA表达水平。试剂盒由康为世纪提供，实时定量 PCR 仪由ABI公司提供的StepOne Plus。仪器经过校标和质控以确保结果的准确性，相关操作严格按照实验流程及试剂说明书进行。

1.3 统计学方法应用EpiData收集数据，整理为Excel表格，采用SPSS 20.0统计软件进行数据统计分析处理，计数资料以频数、构成比描述。组间比较采用卡方检验。计量资料检验是否符合正态分布，近似于正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）的形式描述，组间比较采用独立样本t检验；不满足正态分布的计量资料以四分位数的形式描述，并采用非参数检验（Mann-WhitneyU）。此外相关性分析采用Spearman相关性分析。以原发性高血压病的危险因素及通路相关指标ROCKⅡ、NF-κBp65、ICAM-1、TIMP-1和RhoAmRNA、ROCKⅡmRNA为自变量，是否患有原发性高血压病为因变量，以比值比（OR）作为效应值，进行单因素及多因素二元Logistic回归分析，并通过绘制ROC曲线，筛选切点，计算曲线下面积评估参数预测效力。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 原发性高血压病患者与健康人一般资料比较两组研究对象年龄、性别、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、肌酐（Scr）尿素氮（BUN）等基本资料差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性，表1。

表1 原发性高血压病组与健康组基本资料对比

2.2 原发性高血压病患者ROCKⅡ、NFκBp65、ICAM-1、TIMP-1、RhoAmRNA、ROCKⅡmRNA表达水平与健康组相比，原发性高血压病组的ROCKⅡ、NF-κBp65、ICAM-1、TIMP-1、RhoAmRNA、ROCKⅡmRNA的表达水平均有不同程度升高（P＜0.01），差异均具有统计学意义，表2。

表2 原发性高血压病组与健康组ROCKⅡ、NF-κBp65、ICAM-1、TIMP-1、RhoAmRNA、ROCKⅡmRNA结果对比

2.3 原发性高血压病与上述各指标的相关性分析结果将原发性高血压病与ROCKⅡ、NFκBp65、ICAM-1、TIMP-1和RhoAmRNA、ROCKⅡmRNA进行Spearman相关性检验。结果显示，原发性高血压病与ROCKⅡ、NF-κBp65、ICAM-1、TIMP-1和RhoAmRNA、ROCKⅡmRNA呈正相关（P＜0.05），表3。

表3 原发性高血压病与各指标的相关性分析结果

2.4 原发性高血压病与各个指标的二元Logistic回归分析对以原发性高血压病的相关危险因素及通路相关指标ROCKⅡ、NF-κBp65、ICAM-1、TIMP-1和RhoAmRNA、ROCKⅡmRNA进行单因素Logistic回归分析，表4。并以单因素分析所得的结果为基础，将RhoAmRNA、ROCKⅡmRNA、ROCKⅡ、NF-κBp65作为自变量，以是否患有原发性高血压病为因变量进一步进行多因素二元Logistic 分析，结果显示ROCKⅡmRNA、ROCKⅡ、NF-κBp65与原发性高血压病密切相关（P＜0.05），表5。

表4 原发性高血压病与各指标的的单因素Logistic回归分析

表5 原发性高血压病多因素Logistic回归分析

2.5 原发性高血压病患者ROCKⅡmRNA、ROCKⅡ、NF-κBp65的ROC曲线分析通过绘制ROC曲线，筛选切点，计算ROCKⅡ、ROCKⅡ、NF-κBp65曲线下面积评估参数预测效力，表6和图1。

图1 ROCKⅡmRNA、ROCKⅡ、NF-κBp65的ROC曲线分析

表6 ROCKⅡmRNA、ROCKⅡ、NF-κBp65的参数预测效力分析结果

3 讨论

高血压是指以体循环动脉血压（收缩压和/或舒张压）增高为主要特征，或伴有心、脑、肾等器官的功能或器质性损害的临床综合征。根据其病因是否明确[10]分为原发性和继发性。原发性高血压是由于内皮细胞或平滑肌细胞的变化[11]，粘附分子和细胞外基质成分导致高血压血管表型的分子，结构和功能变化，增加外周阻力。交感神经系统、肾素-血管紧张素-醛固酮系统、ET系统和其他血管活性剂，以及与盐诱导的肠道微生物组营养不良有关的炎症和免疫成分的激活触发，共同导致高血压的血管变化。大量文献表明，Rho/ROCK信号通路与血管内皮通透性、细胞骨架构成、细胞迁移黏附、及血管平滑肌收缩等多种生理功能有关[12]。并对炎症因子有一定的调节作用。国内外文献均已证实炎症因子与原发性高血压病的发生发展以及并发症的严重程度密切相关。此外，高血压本身也可通过改变血液流变学而加重炎症反应。RhoA/ROCKⅡ对炎症因子的调控可能通过NF-κBp65介导。TIMP-1由结缔组织细胞与巨噬细胞产生，广泛存在于组织、体液中，可以被多种细胞因子诱导产生，可与活化的MMP-1、3、9形成复合物而抑制其活性，降低细胞外基质的降解，还具有细胞生长因子样作用，促进成纤维细胞增生及胶原合成，使细胞外基质沉积并抑制其降解[13]。MMP-9与TIMP-1的动态改变调节ECM，从而对原发性高血压的发生发展产生影响。ICAM-1是公认的内皮损伤标记物。在炎症过程中被多种细胞上调。ICAM-1以其介导白细胞与内皮细胞的黏附和引导白细胞穿过血管壁而闻名。当血管内皮受损时，在细胞因子的刺激作用下，ICAM-1作为血管内皮细胞粘附以及白细胞 浸润功能的介导因子，表达水平显著上调[14]。有研究结果显示，压力负荷本身是具有强大的促炎效应，由于机械应变可以诱导血管壁内存在的细胞，包括内皮细胞、平滑肌细胞和炎性细胞浸润，从而诱导炎性细胞因子、生长因子的聚集，氧化应激反应的发生，这些因子的相互作用可以上调 ICAM-1的表达[15]。

本研究通过横断面分析，探讨了原发性高血压病与上述指标的相关性。结果表明，原发性高血压病患者外周血单核细胞中RhoAmRNA、ROCKⅡmRNA表达水平，外周血中ROCKⅡ、NF-κBp65、TIMP-1、ICAM-1表达水平均明显高于健康对照组，差异具有统计学意义（P＜0.01）。Spearman相关性分析结果显示：原发性高血压病与ROCKⅡ、NF-κBp65、TIMP-1、ICAM-1和RhoAmRNA、ROCKⅡmRNA呈正相关。二元 Logistic回归分析结果提示ROCKⅡmRNA（OR=3.698，95%CI：1.365～10.014，P＜0.05）、ROCKⅡ（OR=1.143，95%CI：1.068～1.223，P＜0.001）、NF-κBp65（OR=1.486，95%CI：1.106～1.997，P＜0.01）与原发性高血压病密切相关。绘制其与原发性高血压病相关的ROC曲线，计算曲线下面积评估参数预测效力。根据最佳cutoff值，计算灵敏度和特异性。ROCKⅡmRNA曲线下面积为0.791，当临界值为1.79时，其诊断原发性高血压病的敏感度为86.7%，特异性为70%；ROCKⅡ曲线下面积为0.887，当临界值为34.51 pg/ml时，其诊断原发性高血压病的敏感度为86.7%，特异性为82.5%；NF-κBp65曲线下面积为0.807，当临界值为6.49 pg/ml时，其诊断原发性高血压病的敏感度为93.3%，特异性为58.3%。对原发性高血压病，ROCKⅡ具有一定的预测价值。本研究表明RhoA/ROCKⅡ通路相关指标与原发性高血压病具有显著相关性，特别是ROCKⅡmRNA、ROCKⅡ及NF-κBp65。此外，ROCKⅡ对原发性高血压病具有较好的预测价值，敏感度和特异性较强。在原发性高血压病的发生、发展中可能起到关键作用[16]。此外，本研究中两个炎性因子虽与原发性高血压病具有一定的相关性，但并非疾病的显著相关因素。之后的研究中需要纳入更多RhoA/ROCKⅡ通路相关的炎性因子，并进一步落实亚组研究。在当今的临床环境和小鼠模型中，许多研究已将 ROCK与动脉粥样硬化和高血压病联系起来。由于本研究为横断面研究，且未对原发性高血压患者动脉硬化情况进行评估，未了解其发展情况；ROCKⅡmRNA、ROCKⅡ及NF-κBp65的水平变化与原发性高血压病动脉硬化的相关性仍有待进一步研究，后续将丰富实验方法，并了解RhoA/ROCKⅡ通路相关指标对患者血管长期的影响，以获得更有价值的研究结果。