Ki-67在乳腺癌新辅助化疗中的研究进展

于淼，黄海林，张远起

广东医科大学附属医院 血管甲状腺乳腺外科，广东 湛江 524000

0 引言

根据2020年全球癌症统计数据显示，全球新发乳腺癌女性大约226万例，占全部新发癌症病例的11.7%，超过肺癌成为全球最常见的恶性肿瘤。乳腺癌已经成为女性恶性肿瘤的主要死亡原因，严重威胁着女性的身体健康[1]。新辅助化疗（neoadjuvant chemotherapy，NAC）在局部晚期不能手术的乳腺癌中具有重要的临床应用价值。新辅助化疗不仅可以使局部晚期和无法手术的乳腺肿瘤转化为可手术的肿瘤，也可让部分肿瘤降低分期，进而可以行保乳手术[2]。既往的研究表明，获得病理完全缓解（pCR）的患者新辅助化疗后的总生存期（OS）和无病生存期（DFS）显著延长[3]。因此对于新辅助化疗的疗效及预后进行评估对于乳腺癌的治疗显得至关重要。而通过免疫组化（IHC）检测出的Ki-67作为乳腺癌细胞增殖指标一直被认为是预后指标，Ki-67即抗原Ki-67，是一种10号染色体上mKi-67基因编码蛋白，在细胞分裂活跃期内含量显著增加[4]，在乳腺癌的治疗及预后的评估中有着不可忽视的作用。目前已有不少人研究Ki-67在乳腺癌新辅助化疗中的应用，Ki-67也存在着分析有效性的质疑，但其对乳腺癌治疗的决策有着重要的价值，一直是近几年的研究热点。本文拟对以上问题进行综述。

1 Ki-67基本情况

Ki-67蛋白最初由359kDa的单克隆抗体Ki-67定义，该抗体是于1991年由Gerdes[5]首次从霍奇金淋巴瘤细胞株l248的细胞核免疫小鼠获得的。Ki-67这个名字最初是根据它的起源城市(基尔)和96个井板上的原始克隆数(即第67个克隆)来定义的。Ki-67是一种核DNA结合蛋白，在所有脊椎动物中都有表达，是一种广泛使用的增殖标记物，广泛用于肿瘤分级[6]。既往研究报告显示，Ki-67存在于细胞周期的G1、S和G2期，而不是在静止或静止的细胞g0期，这提示其在许多癌症中作为细胞增殖标志物的作用[7]。通过免疫组化(IHC)分析，确定Ki-67标记指数和阳性频率百分率，可提示患者的预后。Ki-67指数高，一般表现为临床条件预后差[8]。

1.1 Ki-67生物结构

Ki-67是一种非组蛋白核和核仁蛋白，由mKi-67基因编码，定位于人类染色体10q26.2，总外显子数16。Ki-67基因由两种不同的蛋白质异构体组成，它们是由mRNA前体的选择性剪接产生的，根据有无7外显子,分子量分别为320kDa和359kDa[9-11]。对其进行分子克隆，得到16个Ki重复序列，长度为122个氨基酸，由一个6842bp的外显子编码。每个重复序列由半胱氨酸、甘氨酸和谷氨酸等高度保守的氨基酸残基组成，这些氨基酸残基可能具有功能性。每个重复序列都含有由66bp元素编码的高度保守的基序，以及大量的PEST位点，这些位点富含脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)，对蛋白酶活性敏感。Ki-67基序是Ki-67抗体(如MIB-1)识别的表位，通常用于处理人体组织。由于这种性质，抑制剂研究证实Ki-67的生物半衰期小于1h[9,12]。

1.2 Ki-67的功能及表达调控

在G1期Ki-67主要集中的核周区域。在间期，Ki-67主要集中于核仁的致密纤维成分[13-15]。在有丝分裂过程中，核分解呈弥漫性染色，这表明它与染色质有关。当发生染色体凝聚时，Ki-67与其他核仁蛋白如核磷蛋白（B23）、核仁素和核周围蛋白一起出现在染色体周围层。染色体周围层在染色体周围起保护层或膜的作用，在核仁集合时起平台作用[16-17]。Ki-67的一个显著特征是将粒状核仁成分定位于有丝分裂的染色体上，因此在子细胞之间的核仁分离中发挥重要作用[18]。研究人员认为，Ki-67作为一种表面活性剂，可以使染色体运动，并与有丝分裂纺锤体相互作用，从而防止核膜解体后染色体坍缩成染色质团块[19]。研究表明Ki-67在rRNA转录中有作用，这些核糖体发生过程中的特征可能解释了细胞增殖与Ki-67表达之间的联系[20]。最近的报道表明Ki-67与细胞增殖没有直接关系，但它可能通过组蛋白甲基化复合物参与异染色质的压实和组织，这可能是维持异染色质所必需的。

在细胞周期中，首先是通过比较人肿瘤细胞与正常细胞的基因表达谱来确定其增殖特征的[21]。流式细胞术分析显示，Ki-67水平从G1期晚期至S期升高，在有丝分裂时达到峰值，在有丝分裂结束时急剧下降[22-23]。正常情况下，CDK4/6与细胞周期蛋白D形成复合物，并在G1期启动视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）家族的磷酸化，并以低磷酸化形式存在。进而释放与细胞周期转录调节因子（E2F）相关的转录因子，驱动细胞周期进程所需的E2F应答基因的表达。在G1期晚期，Rb的磷酸化，进一步激活E2F介导的转录。然后通过G1/S期边界的限制点，开始S期[24]。当细胞进入细胞周期S期时，Rb高度磷酸化并在整个细胞周期中保持这种状态。磷酸化Rb通过与E2F形成复合物，对基因表达产生负调控作用[25]。由于许多癌症中Rb表达缺失，且Ki-67蛋白可与E2F蛋白结合。E2F过表达会导致Ki-67mRNA积累，导致Ki-67可能低表达或高表达。Ki-67表达的高低可作为阳性评分，以确定Ki-67标记指数，是因为在G0期或静止细胞中只能检测到极低水平的Ki-67水平，而在衰老细胞中，不存在Ki-67[26]。Ki-67水平的调节机制也可能是由肿瘤抑制因子p53控制的。HeLa细胞实验显示p53以剂量依赖的方式抑制Ki-67表达[6]，P53可通过与Ki-67启动子中P53结合基序和Sp1结合位点的相互作用介导Ki-67的转录抑制。

2 Ki-67在乳腺癌中的应用

通过IHC检测出的Ki-67作为乳腺癌细胞增殖指标一直被认为是预后指标，在乳腺癌的治疗及预后的评估中有着不可忽视的作用。既往研究表明，高增殖与低增殖的癌症预后较差，分析有效性、临界值的截取等问题阻碍了这些措施的广泛采用[27-29]。

2.1 Ki-67的分析有效性

Ki-67不能作为一种诊断分析方法实施的关键因素是因缺乏分析有效性。对于包括Ki-67在内的任何肿瘤生物标志物检测，都有许多因素可能会影响结果，包括标本的收集处理与分析报告，以及最终确保分析评估的准确性。有研究为解决实验室之间缺乏一致性，对Ki-67进行了可重复性研究。他们让8个实验室收集100例乳腺癌病例，采用1mm核心组织芯片，均采用抗体MIB-1。每个实验室单独对Ki-67肿瘤细胞阳性染色百分比评分。用组内相关系数（ICC）对重复性进行量化，结果显示Ki-67评分内部一致，ICC为0.94，但实验室间差异ICC为0.59，其结果差异较大，该研究认为影响实验室间差异的因素包括肿瘤区域的选择、计数方法和染色阳性的主观评价[30]。于是他们又引入了在线校准练习和标准化核计数方法以提高可重复性。观察者之间的差异ICC为0.92，符合预先设定的成功标准[31]。以上两个实验证明了Ki-67的标准化评分是可行的，但是受主观评价的影响，其结果在临床中仍有差异，故在传统视觉分析的方法外，出现了自动数字图像评分系统（DIA）。有研究将相同的30个乳腺肿瘤的预染切片送到14个实验室进行扫描和自动评估Ki-67指数。通过10个自动评估软件得出，自动数字图像评分系统评估的平均Ki-67与严格标准化病理学家视觉评估所得Ki-67结果具有较高的一致性[32]。为了证实DIA是一个可行的方案，有研究用三种图像分析测试Ki-67的可重复性，通过对140例乳腺癌患者的研究，其ICC为0.93表明其具有良好的可重复性，并且在三个平台之间其可重复性也具有较高一致性[33]。也有研究人员使用自行开发的DIA与标准病理学家评估进行对比，最后结果依旧是DIA与视觉评估具有良好的相关性[34]。这些研究证明了DIA是一种便捷、准确性高的测量方法，是未来评估Ki-67的趋势。

2.2 Ki-67的临界值

Ki-67在乳腺癌中的临界值一直具有较大的争议。乳腺癌常见的分子亚型有luminalA型、luminalB型、HER-2过表达型和三阴性乳腺癌。Ki-67标记物能够区分乳腺癌的两种分子亚型：luminalA和luminalB肿瘤。Cheang等[35]首先证明了Ki-67在13.25%为临界值时区分luminalA和luminalB时具有72%的敏感性和77%的特异性，能较准确地区分两种亚型。2011年St.Gallen建议将区别luminalA型与B型的临界值定为14%，又在2013年，该截止值被修订为20%，并建议可选择使用基于各自实验室数据的临界值[36]。因目前并未有明确的临界值，故许多研究也在持续寻找最佳临界值。Thangarajah等人定义Ki-67＜10%为低表达，10%～20%定义为中表达，Ki-67＞30%为高表达，通过对802个患者进行分析得出，在DFS的log-rank分析中，Ki-67指数低和中患者的DFS优于Ki-67指数高的患者[37]。有研究包括1951例原发性乳腺癌患者，根据染色百分比，将Ki-67指数进一步分为＜14%、15%～24%、25%～44%、＞45%四组，其结果是Ki-67的没有独立预后意义[38-39]。Kanyılmaz[39]等根据Ki-67水平建立了三个类别：低(＜10%)、中级(10%～25%)和高(＞25%)，结果显示Ki-67水平和肿瘤分级之间存在显著相关性。低级别肿瘤Ki-67低表达相关，高级别肿瘤Ki-67高表达相关，并且Ki-67对预后的影响仅在DFS中得到证实，可能需要更长的随访时间来观察其对OS的影响。Kamranzadeh[40]等的研究证实了Ki-67与乳腺癌分期有关，提示Ki-67在侵袭性较强的肿瘤中水平较高，但同样证实了Ki-67不能作为侵袭性乳腺癌的独立预后因素，且Ki-67与激素受体、HER2等一些预后因素之间没有显著的关系，Ki-67与3年、5年DFS、5年OS无显著差异。Aman[41]等按照2011年St.Gallen建议将Ki-67分为≤15%组，16%～30%组，＞30%组，该研究发现Ki-67表达水平与肿瘤分级呈正相关。肿瘤分级越高，Ki-67越高，他们认为免疫组化检测Ki-67与ER、PR和HER2结合，给出乳腺癌分子亚型，其预后和治疗具有重要意义。尤其对于年轻女性三阴性乳腺癌（TNBC）患者Ki-67的高价值，需要进行彻底的研究。邵志敏团队[42]对TNBC中Ki-67的最佳临界值有进一步的研究，通过对1800例早期侵袭性TNBC患者的分析，得出Ki-67与预后最相关的临界值值为30%，此时OS和DFS具有早期独立预后和预测潜力，Ki-67＞30%与预后较差显著相关。以上诸多研究中Ki-67临界值在10%～45%之间，可见对于最佳临界值仍有较大的争议，虽然存在争议但是其对乳腺癌的治疗及预后依旧有着重要的指导意义。

3 Ki-67在乳腺癌新辅助化疗中的作用

新辅助化疗（NAC）是目前局部晚期乳腺癌（LABC）和早期乳腺癌（EBC）的标准治疗方法。NAC的主要目的是将不能切除的肿瘤转化为可手术的肿瘤，以及将肿瘤的分期降低，以行保乳手术而不是乳房切除术。在新辅助化疗中Ki-67指数在治疗前后，对乳腺癌的疗效评估以及预后都具有一定的指导作用，但仍不能在临床工作中起决定性作用。

3.1 新辅助化疗前Ki-67指数

已有许多研究表明，在新辅助化疗前Ki-67指数就已经提示了乳腺癌化疗的疗效及预后的结果。Jain P[43]等为确定乳腺癌患者Ki-67水平与乳腺癌pCR相关性，单因素分析表明，较高的Ki-67指数＞35%与较好的pCR率相关。多因素分析显示，Ki-67指数＞35%是pCR的独立预测因素。该研究表明Ki-67高与pCR呈正相关。Wajid[44]等通过对80例乳腺癌患者进行分析，同样采用35%作为Ki-67的临界值，Ki-67高表达患者中，其中63%出现pCR，26%出现部分病理缓解，11%出现疾病进展。相反，Ki-67低表达患者中，17%出现pCR，58%出现部分病理缓解，25%出现病情进展。该研究也证实了Ki-67高与pCR呈正相关。既往研究中，Gluz O[45]等在新辅助治疗试验中，早期乳腺癌易获得pCR，较高的Ki-67表达与化疗敏感性相关。也有研究表示Ki-67＞20%的肿瘤患者，证实NAC治疗效果更好[46]。通过以上研究我们大致可以得出较高的Ki-67相比于较低的患者更易获得pCR且对NAC有更高的敏感性。

3.2 新辅助化疗后Ki-67指数

在新辅助治疗结束时，仍会有部分病人不能达到pCR，在残留肿瘤中的Ki-67与长期预后有很强的相关性。Minckwitz[47]等为研究Ki-67在新辅助化疗后残留病变中的价值，在GeparTrio研究的参与者随机接受新辅助化疗后用IHC测定Ki-67水平。治疗后Ki-67水平较高的患者复发率和死亡率高于中低水平的患者。Ki-67水平低的患者与pCR组结果相似。治疗后Ki-67水平比治疗前Ki-67水平或治疗前后Ki-67水平的变化提供了更多的预后信息。该研究认为较高的Ki-67会到来较差的预后，建议可更改后续的治疗方案。Luigi Rossi[48]等发现NAC可以改变乳腺腺癌患者Ki-67的表达状态，中位Ki-67值在化疗前活检为20.9%，在化疗后为18%，在病理反应患者化疗后，Ki-67表达水平显著降低。该研究认为即使部分患者没有获得pCR，在NAC后Ki-67降低的患者最有可能受益。Pistelli[49]等将Ki-67变化在未达到pCR的患者，根据Ki-67分为高降低(＞20%)、低降低组(1%～20%)和无变化组。Ki-67的变化与DFS和OS有显著的相关性。与Ki-67降低与不降低患者相比，Ki-67降低程度高(＞20%)患者的生存率较高。在该研究中，Ki-67在未达到pCR患者的改变显示了在接受NAC治疗中显著的预后作用。Ding[50]等研究表明NAC治疗后Ki-67表达增加的患者的死亡风险比Ki-67表达稳定的患者高2.05倍。Ki-67表达增加20%的患者与Ki-67表达稳定或下降的患者相比，DFS更差。Ki-67表达稳定组与Ki-67表达降低组预后相同。Ki-67表达增加20%与DFS显著恶化相关。Ki-67表达升高的患者的疾病复发风险比Ki-67表达稳定的患者高1.91倍。Ki-67表达低的患者与病理完全缓解的患者预后相似。NAC后Ki-67高表达的患者DFS和OS较短。导致NAC后Ki-67表达的增加的原因可能是化疗主要杀死主动增殖的肿瘤细胞，间接促进G0期残留肿瘤细胞主动代谢或再次进入分裂周期。在这种情况下，Ki-67可以在肿瘤细胞中重新表达。另一方面，Ki-67高表达可能也与化疗耐药相关。以上研究表明新辅助化疗前，及化疗前后Ki-67对于乳腺癌患者获得pCR以及未获得pCR患者的预后进行了评估，我们可根据其指导意义对部分患者的治疗方案予以及时调整，以便达到最佳治疗效果。

综上所述，Ki-67是与肿瘤细胞增殖密切相关的核蛋白，是一种重要的肿瘤标志物，可根据其在乳腺癌新辅助化疗前后变化来评估疗效及预后。Ki-67临界值一直存在争议，传统人工Ki-67视觉评分虽然可有较高可重复性，但仍存在主观差异，不同实验室之间Ki-67指数对比性差异较大，而自动数字图像评分系统（DIA）的出现有利于解决Ki-67的分析有效性问题，随着更多研究的跟进，该系统在未来可能值得广泛推广，从而提高Ki-67分析有效性。多项研究表明高Ki-67预示着其对新辅助化疗敏感，可能取得较好的疗效，同时对新辅助化疗后pCR有预测作用，新辅助化疗前的Ki-67值以及Ki-67值的变化也可能是乳腺癌患者OS和DFS的预后因素。这些研究可为提高乳腺癌病理完全缓解及疾病的预后提供参考，并为调整治疗策略给出依据，进而实现乳腺癌的精准治疗。