基于脂质组学的土鳖虫炮制品脂肪油含量

2022-03-16 09:03黄莹洁史雪姣赵倩楠张加余满玉清王少平
滨州医学院学报 2022年1期
关键词:炮制脂质甘草

黄莹洁 刘 鑫 黄 成 史雪姣 赵倩楠 田 源 代 龙 张加余 满玉清 王少平

1 滨州医学院药学院 山东 烟台 264003; 2 复旦大学附属肿瘤医院闵行分院 上海 200240

土鳖虫为鳖蠊科昆虫中华冀土鳖和地鳖等干燥雌虫体,始载于《神农本草经》,列中品,具活血逐瘀、破血消癥之效。中医临床多将其用于跌打损伤,筋伤骨折,血瘀经闭,产后瘀阻腹痛,瘾瘕痞块等病证的治疗。现代药理学研究表明,土鳖虫单味药材及其复方制剂对高脂血症、高血压、血管性炎症和类风湿关节炎等疾病具有明确的效果,且副作用小于临床常用西药。因此,对土鳖虫的需求量日益增加[1-5]。

目前土鳖虫常用炮制品为其干品,且这一饮片规格被收载于历版《中国药典》和多个地方中药材炮制规范内。本研究前期对土鳖虫烘干的炮制方法进行本草考证,发现此炮制方法最早出现于汉代,经唐宋两代沿革至清朝时逐步规范化。《全国中药材炮制规范》1988年版规定:“土鳖虫,或晒干、沥干,或置炒锅内,炒制干燥,即得”。目前,干土鳖虫已成为中药材市场内主要的饮片。《湖北省中药材炮制规范》2009年版明确了甘草制土鳖虫的炮制方法和临床应用,对两种土鳖虫炮制饮品的功效进行比较,发现两者并无区别[6-12]。

动物类中药是中药的重要组成部分。作为血肉有情之品,其药效较植物药更加明确高效。动物类中药的主要成分为蛋白质,其次为脂质类成分。研究者围绕其蛋白质的组成、功能和药效进行了大量工作,并取得了一系列成果,例如水蛭中的水蛭素、地龙中的纤溶酶和蛇毒蛋白的发现。但动物类中药常具有一定的偏性,需经过净制、炒制和酒制等不同炮制处理后方可用于临床。炮制方法的不同会导致动物类中药蛋白质的变性,但不会造成其含量的增减。而脂质类成分,例如油酸、亚油酸和甘油磷酯类成分可受高温影响而发生结构转变。甘草的调和诸药之特性,加之其所含的皂苷成分表面活性剂的特点在炮制药材中可能造成其脂质成分的丢失。由此推测,干土鳖虫和甘草制土鳖虫的脂质成分可能存在一定差异,但具体的成分差异性目前未见相关报道。

脂质组学是以系统生物学为载体,从整体性、规模性和科学性上对全部脂质进行测定的一门新兴技术,其整体性的研究方法可弥补传统气相质谱所表现的单一性、稳定性差和低重复性的不足,目前已被广泛应用于疾病机制新靶点发现、药物作用靶点修正和动植物脂质积累差异等研究[13-15]。本研究运用脂质组学技术,辅以整体数据分析方法对干土鳖虫和甘草制土鳖虫的脂质差异进行系统分析,明晰两种土鳖虫炮制品中的脂质差异,为后期土鳖虫的全物质研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料 土鳖虫(产自山东省长清区,经滨州医学院代龙教授鉴定为鳖蠊科昆虫中华冀土鳖的干燥雌虫体),甘草(产自河北省安国县,经滨州医学院代龙教授鉴定为光果甘草GlycyrrhizaglabraL.的干燥根);石油醚(沸程60~90℃,批号为20201021,购自于国药集团化学试剂有限公司);无水乙醇(批号为2020年5月5日),异丙醇(批号为20201208),乙腈(批号为20200403),以上均为分析级,购自于天津富宇化学试剂有限公司;去离子水(批号为20210307,杭州娃哈哈纯净水有限公司)。1.5 mL EP管,10 cm玻璃棒,1、2.5 mL一次性注射器,0.5、2 mL液相小瓶,500 mL圆底烧瓶,100、500 mL量筒,100 μL、1mL一次性枪头。

1.2 实验仪器与设备 KQ-500V型超声波清洗器(500 Hz,购自于昆山市超声仪器有限公司),KDM型调温电热套(2000 W), SCIEX Exion LC联合5600 Q-TOF mass spectrometer (AB Sciex,Foster City,CA,USA)液质联用仪,球形冷凝管,电磁炉,圆底烧瓶。

1.3 实验方法

1.3.1 甘草制土鳖虫的制备 取甘草30 g,置于铁锅内,加水300 mL,煎煮30 min,趁热滤过,保留初滤液;残渣再加水150 mL,煎煮15 min,过滤后将两次滤液合并,减压浓缩至150 mL备用。取干土鳖虫500 g,置于甘草水内,浸润30 min至润透,后依据《中国药典》2020年版“清炒法”项下操作方法进行操作,放凉,即得甘草制土鳖虫饮片。

1.3.2 脂质样品的制备 取干土鳖虫和甘草制土鳖虫适量,各6份,粉碎,过100目筛,粉末分别置于500 mL圆底烧瓶内,再加入500 mL石油醚,置于电热套内,采用回流提取方法对土鳖虫两种炮制品的总脂质进行提取;提取时间设置为2.0 h,分别过滤,收集滤液;再加入相同体积的石油醚重复以上实验步骤,分别将两种土鳖虫炮制品的石油醚提取液进行合并,减压回收(-0.080~-0.10 mPa,40℃)石油醚,制得干土鳖虫总脂肪油和甘草制土鳖虫总脂肪油。

取以上两种土鳖虫炮制品总脂肪油各200 μL,置于1.5 mL EP管中, 13 000 r/min离心10 min,取上清液。吸取20 μL上清液于1.5 mL EP管中,加入180 μL异丙醇-乙腈(90∶10)稀释10倍,涡旋10 min,12 000 r/min离心10 min,取上清溶液100 μL于进样小瓶内插管,分别标记为C1~C6,GC1~GC-6。

1.4 数据采集

1.4.1 液相条件 色谱柱为Waters Acquity BEH C18 column(2.1 mm×150 mm,1.8 μm)。流速为0.3 mL/min,进样体积为1 μL,柱温为55℃。流动相A为水—乙腈(40∶60,含0.1%甲酸与5 mM甲酸铵);流动相B为异丙醇—乙腈(90∶10,含0.1%甲酸与5 mM甲酸铵),采用梯度洗脱方法,梯度设置见表1。

表1 流动相梯度洗脱顺序设置

1.4.2 质谱条件 电喷雾离子源,正负离子采集模式,其中漂移管温度为550℃,喷雾电压为55 kv,毛细管电压为-55 kv,鞘气流速为55 psi,辅助气流速为55 psi,扫描范围为150~1 050 m/z,分辨率分别为70 000(一级)和30 000(二级),归一化能量为40%。

2 结果

2.1 差异脂质成分筛选 采用设定的色谱和质谱条件对样品进行分析,通过其质谱图发现在最优条件下,两种脂质样品分离尚可(图1)。其中干土鳖虫内鉴定出85种脂质成分,包括甘油脂(GL)37个,脂肪酸(FA)37个,甘油磷脂(GP)10个,固醇脂(ST)1个。将其数据对齐后导入SIMCA 14.0软件进行PCA和OPLS-DA分析,筛选差异物质。其中PCA得分图揭示在正负离子模式下,土鳖虫干品和甘草制土鳖虫的脂质样品组完全分开,其中正离子模式下R2X 0.824,Q2 0.742,而负离子模式下R2X 0.757,Q2 0.537,说明模型拟合良好(图2)。

图1 干土鳖虫和甘草制土鳖虫的BPC图

a. 正离子模式下的PCA分析;b. 负离子模式下的PCA分析。

在OPLS-DA分析中,干土鳖虫和甘草制土鳖虫的脂质样本也完成分开,同时采用以下条件进行差异性变量筛选:VIP大于1.0;t检验,P<0.05;S-plot中P>0.05且Pcorr>0.3。共筛选出差异脂质成分68个(图3)。

a. 正离子模式下的OPLS-DA分析;b. 负离子模式下的OPLS-DA分析;c. 正离子模式下的S-plot分析结果;d. 负离子模式下的S-plot分析结果。

2.2 差异脂质成分分析 将两种土鳖虫炮制品的差异脂质成分的精确相对分子质量m/z、相对保留时间tR进行整理,并运用HMDB和Metlin等代谢物鉴别数据库,辅以Pubchem和chemspider等化合物公开数据库,并根据二级裂解碎片离子碎片信息,对化合物进行鉴别,最终发现:两种土鳖虫炮制品脂质差异成分主要分为4类,分别为甘油脂类(32个),脂肪酸类(26个),甘油磷脂类(9个),固醇脂类(1个)(表2)。

根据差异脂质成分在Q OTF中的响应值,并利用SCIEX OS-Analyst软件收集干土鳖虫差异脂质成分的保留时间tR)和峰面积(A),建立tR-A的数据矩阵。以干土鳖虫饮片中的差异脂质成分的色谱信息为基准,计算甘草制土鳖虫差异脂质成分的峰面积差异率(%),公式为:

式中A1为tR下的甘草制土鳖虫差异脂质成分峰面积,A为tR干土鳖虫差异脂质成分峰面积。

由以上公式结合差异脂质成分信息得出,两种土鳖虫炮制品中多种脂质成分的相对含量存在差异。其中,土鳖虫与甘草制土鳖虫差异脂质比较,甘草制后甘油二酯类低于炮制前,其余均高于炮前(图4)。这说明,土鳖虫油脂在经甘草炮制后含量明显减少。

表2 两种土鳖虫炮制品的差异脂质成分

图4 土鳖虫炮制前后各类脂质成分相对含量变化结果

3 讨论

炮制工艺是中药在进入临床前最重要的药物处理技术,目前已逐步发展为一门学科。中医医家古籍对中药炮制技术和方法具有严格的考证,同时也对药物炮制前后的药性变化进行了分析。本研究前期对土鳖虫的炮制方法进行充分考证,得出土鳖虫自古以来的炮制方法有熬、炒、焙、烘、油炸、油焙和甘草伴炙等。现代最常用的土鳖虫炮制方法则为炒法和甘草水制法。本研究以目前市场常见的炒土鳖虫和甘草水制土鳖虫为材料进行实验。

中医认为,动物类中药均存在部分偏性或毒性,例如土鳖虫的小毒特性,蚕蛹和美洲大蠊的滑肠偏性[16-18]。脂质是动物类中药中除蛋白质以外的第二大类成分,且脂质可能是造成动物类中药偏性的主要物质。美洲大蠊油脂可引起小鼠肾脏毒性,且这一效果与美洲大蠊中的棕榈酸含量高存在直接关系[19-20]。不同的炮制方法可能对消除或减弱动物类中药脂质所造成的毒性和偏性具有显著效果。

综上所述,本研究采用脂质组学技术对干土鳖虫和甘草制土鳖虫中的脂质进行对比分析,发现两种炮制方法对土鳖虫脂质成分种类和相对含量存在明显差异。本研究将为土鳖虫不同炮制品的全物质成分分析提供可借鉴的思路。

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