177份小麦种质资源低分子量麦谷蛋白基因型分析

周国雁， 陈 丹， 伍少云， 隆文杰， 武晓阳， 蔡 青

(云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所/云南省农业生物技术重点实验室/农业农村部西南作物基因资源与种质创制重点实验室， 昆明 650205)

小麦胚乳贮藏蛋白中麦谷蛋白、醇溶蛋白[1]的含量及其二者的比例决定着面粉的二次加工品质。其中，不同的麦谷蛋白在SDS-PAGE电泳中的迁移率不同，被分为高分子量麦谷蛋白(High Molecular Weight，HMW)和低分子量麦谷蛋白(Low Molecular Weight，LMW)。HMW麦谷蛋白只占麦谷蛋白总量的25%～40%、贮存蛋白或面筋蛋白的10%左右[2]，但能解释小麦面粉品质变异的30%～79%[3]，由于位于1 A、1 B、1 D染色体长臂上的Glu-1基因座位的相关亚基(glutenin subunit，GS)控制，决定着面团的延展性和面筋弹性，对面包烘烤品质和面制品蒸煮品质有着重要影响，是改良小麦品质的关键遗传因素[2]。LMW麦谷蛋白约占麦谷蛋白总量的60%左右，由1 A、1 B和1 D染色体短臂上的Glu-3基因座位[4]的相关基因控制，决定着面团的强度和粘度，尤其是对面筋拉伸阻力和延展性[5]的影响甚至超过了HMW-GS[6]，也是改良小麦面粉二次加工品质的重要遗传因素。

研究表明，Glu-3座位内不同的位点也有不同的效应，其中对面团强度贡献的顺序为：Glu-A3位点，d>f>c>b>e；Glu-B3位点，g>b>f>i>d>a>h>c；对面团延伸性贡献的顺序为：Glu-A3位点，c>d>f>b>e；Glu-B3位点，i>b>a>f>g>h>c>d；而Glu-D3位点的基因之间对品质性状的影响差异较小，所以将Glu-A3d、Glu-B3b、Glu-B3g和Glu-B3i确定为优质LMW-GS[7]。对于中国小麦品种，与面包、面条品质紧密相关的LMW-GS位点是Glu-A3和Glu-B3，因为对和面时间的影响表现为Glu-B3>Glu-A1=Glu-B1=Glu-A3，对面团耐揉性的影响表现为Glu-B3=Glu-B1>Glu-A3>Glu-A1，对沉淀值的影响表现为Glu-B3>Glu-B1>Glu-A1>Glu-A3(Glu-A1、Glu-B1为HMW-GS)[8-9]。所以，对于中国优质面包、面条小麦品种，Glu-B3位点更为重要一些。另外，不同LMW麦谷蛋白基因的组合对面粉加工品质的影响也不同，带有基因组合Glu-A3b+B3b+B3d、Glu-A3b+B3b+B3c、Glu-A3c+B3b+B3c的品种，一般大都具有优异的面包品质[10]。

常用于检测LMW-GS等位变异的方法有SDS-PAGE电泳、双向电泳、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和PCR扩增等。SDS-PAGE技术应用广泛，但因LMW-GS带型复杂，且与醇溶蛋白条带重叠，很容易造成误读误判；双向电泳虽然分辨率高，但适合性或通用性有待进一步证明，因为这种方法区分不了一些特殊的LMW-GS；MALDI-TOF-MS能够较好地区分Glu-D3位点的等位变异，但是对Glu-A3和Glu-B3位点的等位变异识别效果不佳，且仪器昂贵[11-12]。相对而言，PCR方法是最简单、方便的一种方法。因此，为快速筛选、发掘优质LMW-GS的品种或育种材料，Wang等[13-14]根据在Glu-A3、Glu-B3位点克隆的基因序列开发了检测Glu-A3、Glu-B3位点不同基因的STS标记。Zhang等[15]、Van Campenhout等[16]分别开发出可检测基因Glu-A3d、Glu-B3的功能标记；而Francis等[17]和Chai等[18]分别开发出检测1 B/1 R易位系基因Glu-B3j、ω-secalin的PCR标记。

本试验前期，已经有研究者利用SDS-PAGE方法鉴定并分析了云南省省级作物种质资源库保存的云南不同历史时期选育的152份小麦品种(系)的LMW-GS组成与分布[19]，发现其中66份(43.4%)材料携带优质HMW-GS 1，84 D 2-2813、滇801、靖343等3份材料带有优质亚基13+16，73-16、802-87、凤0483、云麦54、靖麦12号等12份(7.9%)材料带有优质亚基14+15，822-698、832-63、春980、滇7034、凤麦34、云选11-12等20份(13.2%)材料带有优质亚基17+18，832-714、862-103、春980、凤0483、凤麦34等8份材料带有优质2+10，福利麦、云麦27号、0230、云麦36、云选11-12、临麦15号等37份(24.3%)材料带有优质亚基5+10，832-63、滇7034、靖343、云麦61等24份(15.8%)材料带有优质亚基5+12；84 D 2-2813、832-63、春980、凤0483、滇7034、靖343、靖麦12号、凤麦34、云选11-12等17份(10.5%)材料具有优质亚基组合13+16、或14+15或17+18、2+10、或5+10或5+12。品质评分在7分及以上的材料24份，占15.8%，如福利麦、822-852、云麦42号、云选11-12、临麦15号等。可见，这些品种(系)中有较高比例可开展优质小麦育种的优质亲本，为充分利用这些优质育种材料改良，提高云南选育小麦品种的面粉加工品质，本研究利用上述文献报道的分子标记，在基本明确HMW-GS组成基础上进一步弄清这些材料所带有的LMW-GS，以期筛选或挖掘出HMW-GS和LMW-GS都表现优异的材料或品种(系)，并为其育种利用提供分子生物学参考依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试品种(系)为云南省省级作物种质库保存的云南省选育品种79份(表2标注为“V”)、品系78份(表2标注为“L”)、省外或境外引进的材料20份(表2标注为“I”)。在选育品种(系)中152份已鉴定HMW-GS的组成，其中在Glu-A1(1)、Glu-B1(13+16或14+15或17+18)和Glu-D1(5+10或5+12)三个位点都为优质HMW-GS的材料10份，如84 D 2-2813、832-63、丽育1号、滇7034、昆7808、德麦2号、滇89 D 2-29、楚麦9024、靖343和云选11-12等；在Glu-B1(13+16或14+15或17+18)和Glu-D1(2+10或5+10或5+12)两个位点为优质HMW-GS的材料16份，如84 D 2-2813、832-63、春980、凤0483、滇7034、靖343、靖麦12号、凤麦34、云选11-12等，占10.5%。品质评分在7分及以上的材料24份，如福利麦、822-852、云麦42号、云选11-12、临麦15号等，占15.8%。

1.2 实验方法

1.2.1DNA提取

每份参试材料随机选取50粒种子催芽生长至第7天，取新鲜幼嫩的混合麦苗，用CTAB法[20]提取全基因组DNA，用紫外分光光度计检测DNA浓度，然后稀释至100 ng/μL。

1.2.2PCR扩增与电泳检测

用于检测参试材料LMW-GS的分子标记共15对(表1)，其中Glu-A3座位5对，即引物P 1～P 5，分别检测Glu-A3a、Glu-A3b、Glu-A3d、Glu-A3e等4个基因。Glu-B3座位10对，即P 6～P 15。这些引物均由擎科生物技术有限公司合成。PCR扩增体系为20 μL，包括2×TSINGKE Master Mix 10 μL,上下游引物各0.4 μL(10 μmol/L)，模板DNA 1.5 μL(25 ng/μL)，ddH2O 7.7 μL。扩增程序为：95 ℃ 3 min；94 ℃ 50 s，50～55 ℃退火45～50 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 3 min。扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

表1 试验选用的15种标记

2 结果与分析

15对引物中有7对(P 1、P 2、P 3、P 7、P 8、P 11和P 14)在所有参试材料中都无扩增产物，剩余8对引物在157份参试材料中扩增到目标条带(表2)，占参试材料总数的88.7%，另外20份参试材料无目标条带或扩增产物，约占参试材料总数的11.3%。

表2 177份云南育成及引进小麦种质资源低分子麦谷蛋白基因检测结果

表2(续)

表2(续)

表2(续)

在Glu-A3基因座位，除引物P 1、P 2和P 3在所有参试材料中都无扩增产物外，引物P 4在德宏508-512、巧家3号、保山农选3号、云麦33和滇802-87等45份材料中能扩增到488 bp的目标条带(图1)，约占157份材料(下同)的28.7%，说明这些参试材料带有低分子量麦谷蛋白基因Glu-A3d。P 5引物在云麦20号、云南778、78鉴-35、怒江662-525-2、昆麦1号和云植803等6份参试材料中扩增到158 bp的目标条带(图2)，说明这些参试材料带有低分子量麦谷蛋白基因Glu-A3e，约占3.8%。

注：M为Maker DL 2000；1～24依次为云麦34、云麦33、昆麦1号、滇84 D 2-2813、滇822-852、滇802-87、滇812-244、滇822-698、滇832-63、滇832-653、滇832-714、滇842-254、滇852-18、滇852-181、滇852-192、滇852-685、滇862-39、滇862-103、滇862-753、滇437、云植803、 春980、凤系7849、凤麦18。

注：M为Maker DL 2000；扩增到158 bp条带的材料依次为云麦20号、云南778、78鉴-35、怒江662-525-2、昆麦1号和云植803。

在Glu-B3座位，Glu-B3基因的引物P 6在麒麟福利麦、迪庆79格选4号和云麦20号等105份参试材料中扩增到636 bp的目标条带(图3)，说明这些材料带有低分子麦谷蛋白基因Glu-B，约占66.9%。

注：M为Maker DL2000；1～24依次为云麦34、云麦33、昆麦1号、滇84 D 2-2813、滇822-852、滇802-87、滇812-244、滇822-698、滇832-63、滇832-653、滇832-714、滇842-254、滇852-18、滇852-181、滇852-192、滇852-685、滇862-39、滇862-103、滇862-753、滇437、云植803、 春980、凤系7849、凤麦18。

P 9引物仅在文山1011、巧家2号、辽春10号3份材料中扩增到Glu-B3c基因472 bp的目标条带(图4)，约占1.9%；引物P 10在云麦27号、原墨1号、红河红辐1号、78鉴-35等22份材料中扩增到Glu-B3g基因的目标条带853 bp(图5)，占14.0%；引物P 12在大理凤系7901、滇832-63、滇842-254等14份材料中扩增到Glu-B3h基因的目标条带1 022 bp(图6)，占8.9%；引物P 13在云南778、滇7206、德麦3号、绵阳11号等22份材料中扩增到基因621 bp的目标条带(图7)，占14.0%；引物P 15在滇822-852、滇812-244、滇862-39、滇862-103等共50份材料中扩增到ω-secalin基因的1 100 bp，说明大约28.2%的材料都带有ω-secalin或Glu-B3j基因(图8)。

注：M为Maker DL 2000；1～33依次为麒麟福利麦、迪庆79格选4号、迪庆79格选5号、迪庆79格选10号、迪庆79格选13号、云麦20号、云麦27号、云麦29号、滇484、云南778、原墨1号、文山1011、红河红辐1号、红河南平麦、78鉴-35、保山墨巴66/原农53、德宏508-512、滇73-16、滇84 V-417、滇84 V-418、盈江滇175、滇7206、滇7208、巧家1号、胚育1号、巧家2号、巧家3号、滇726、怒江662-525-2、大理凤系7901、石屏南原1号、西南36-428、保山农选3号。

注：M为Maker DL 2000；1～33依次为麒麟福利麦、迪庆79格选4号、迪庆79格选5号、迪庆79格选10号、迪庆79格选13号、云麦20号、云麦27号、云麦29号、滇484、云南778、原墨1号、文山1011、红河红辐1号、红河南平麦、78鉴-35、保山墨巴66/原农53、德宏508-512、滇73-16、滇84V-417、滇84V-418、盈江滇175、滇7206、滇7208、巧家1号、胚育1号、巧家2号、巧家3号、滇726、怒江662-525-2、大理凤系7901、石屏南原1号、西南36-428、保山农选3号。

注：M为Maker DL 2000；1～33依次为云麦34、云麦33、昆麦1号、滇84 D 2-2813、滇822-852、滇802-87、滇812-244、滇822-698、滇832-63、滇832-653、滇832-714、滇842-254、滇852-18、滇852-181、滇852-192、滇852-685、滇862-39、滇862-103、滇862-753、滇437、云植803、 春980、凤系7849、凤麦18、大理凤803N2-30-18-1、大理819M9-1-9、大理819M4-2-6、大理凤0483、大理凤0103、大理凤0230、滇801、靖麦2号、丽育1号。种(洛夫林13)血统的材料只有滇822-852(ZM 17034，云0637)1份，

注：M为Maker DL 2000；1～33依次为麒麟福利麦、迪庆79格选4号、迪庆79格选5号、迪庆79格选10号、迪庆79格选13号、云麦20号、云麦27号、云麦29号、滇484、云南778、原墨1号、文山1011、红河红辐1号、红河南平麦、78鉴-35、保山墨巴66/原农53、德宏508-512、滇73-16、滇84 V-417、滇84 V-418、盈江滇175、滇7206、滇7208、巧家1号、胚育1号、巧家2号、巧家3号、滇726、怒江662-525-2、大理凤系7901、石屏南原1号、西南36-428、保山农选3号。

注：M为Maker DL 2000；1～24依次为云麦60、云麦61、云麦62、云麦63、云麦64、云麦56、靖麦17号、靖麦19号、临麦6号、临麦15号、临麦16号、文麦8号、文麦9号、文麦11号、文麦14号、云麦52、云麦68、云麦101、多穗白、多穗白(红粒)、滇75-041-1、昌0245-17-6、繁六、保山杂交种1756/农选3号。

3 讨 论

3.1 利用Glu-B3、Glu-B3j、ω-secalin基因引物鉴定1 BL/1 RS易位系的可靠性

Van Campenhout等[16]认为，携带1 BL/1 RS的品种能够通过Glu-B3基因引物PCR产物的缺失来区分。但文中Glu-B3基因引物O 11 B 5(GGTACCAACAACAACAACCC)和O 11 B 3 (GTTGCTGCTGAGGTTGGTTC)，分别是本文引物P 6的F和R，是根据T.aestivumGlu-3gene序列(X 84887、X 84960)设计的，产生的636 bp产物位于可变重复区域(variable repeat domain)，与黑麦遗传信息无关。另外，Glu-B3基因位于1 B染色体短臂，而1 BL/1 RS易位系是小麦1 B染色体长臂的部分或片段被黑麦1 R染色体短臂的一部分所取代，理论上1 BL/1 RS材料都应具有染色体1 BS。在Chai[18]的研究中，虽然P 6引物在1 BL/1 RS材料中无扩增产物，但并没有暗示可以用这对引物来鉴别1 BL/1 RS 材料。因此，尽管本文引物P 6对德麦4号DNA的扩增与梁强等[21]的结果一致，无PCR产物，但是Ali N等[22]、魏学军等[23]、梁强等[21]用引物P 6有无PCR扩增产物来区分1 B/1 R易位系是欠妥的。至于Francis等[17]设计的Glu-B3j基因引物(P 14)，虽然是小麦背景下快速检测黑麦染色质的有用工具，但对于本文所有参试材料均无PCR扩增产物，也许与此引物本身稳定性、通用性，或本文参试材料遗传背景有一定关系。中国1 BL/1 RS品种大多与洛类，即洛夫林系列品种有关，根据《中国小麦遗传资源目录1976—1986，第一分册(国内部分)》记载，本试验材料中明显带有洛类品用Chai[18]根据黑麦ω-secalin基因序列设计的引物P 15对其DNA扩增，表明其带有ω-secalin基因，为1 BL/1 RS系材料，与系谱信息一致。所以，与引物P 6、P 14相比，用引物P 15来区分1 BL/1 RS易位系也许更可靠一些。本研究以引物P 15共筛选出1 BL/1 RS材料50份，占有PCR产物材料157份的31.8%，如品系滇822-852、滇812-244、滇862-39、品种春980、云麦38、云麦51、德麦4号等。可见，1 BL/1 RS材料在参试材料中占有相当高的比例。但是，这些材料不宜作为优质小麦育种研究的亲本[24]，因为1 BL/1 RS易位系虽然具有矮秆、高抗和丰产等特性[25]，携带有抗条锈病基因Yr9、秆锈病基因Sr31、叶锈病基因Lr26和白粉病基因Pm8[26]，然而由于1 RS黑麦碱蛋白使面团的吸水性和水溶性增大，造成面团发粘，面筋质量下降，使面粉加工品质变劣[27-29]。

3.2 同时携带优质HMW-GS和LMW-GS材料的应用前景

根据Zhang等[7]确定的优质LMW-GS基因Glu-A3d、Glu-B3b、Glu-B3g和Glu-B3i，本试验筛选出携带Glu-A3d、Glu-B3g、Glu-B3i单个优质LMW-GS的材料共63份；带有优质LMW-GS组合Glu-A3d+Glu-B3g的材料有巧家3号(云0538)、墨依(云0962)和中作8131(云1217)等3份，带Glu-A3d+Glu-B3i的材料有滇802-87(云0638)和云麦33(云1260)2份；带Glu-B3g+Glu-B3i的材料只有绵阳11号(云0963)1份。结合广泛公认的优质HMW-GS 1、13+16或14+15或17+18和5+10或5+12，筛选出同时具有优质高、低分子量麦谷蛋白基因组合的材料4份，如带有1、17+18、5+12、A3d基因组合的材料滇832-63和昆7808；带有1、17+18、5+12、B3g基因组合的楚麦9024，带有13+16、5+12、B3g基因组合的滇801等。这10份优质种质资源，占总参试材料数的5.6%，比例很小，应成为云南小麦优质品种选育重点研究和利用的亲缘材料。其中，中作8131、云麦33号是优质面包小麦品种，绵阳11号是具有广泛适用性的生产用种。另外，这些优质种质资源材料都是选育品种(系)，不像原始或地方品种具有很多育种研究难以在短时改良的不良性状，因而在育种研究中获得新品种(系)的机会相对更高一些。