基于EST-SSR标记的19份子莲品种资源遗传多样性分析

李怡鹏， 石 林， 杨梦飞， 郑寨生， 张尚法， 王凌云

(金华市农业科学研究院/浙江省特色水生蔬菜育种与栽培重点实验室, 浙江 金华 321000)

莲在生产用途上被分为三类，分别是藕莲、子莲和花莲[1]。子莲，以采收莲子为主，花苞多，花瓣以单瓣为主，花色以红色居多，偶有白色，莲蓬大，结实率高，但地下茎细长，分枝多[2]。近几年随着市场的需求变化，子莲品种又有加工干莲与鲜莲之分[3]。现阶段最常见的有性杂交育种仍然是子莲遗传育种的主要技术之一，而选配杂交亲本组合是进行杂交育种最先启动也是最重要的环节[4-5]。亲本组的选配首先考虑到的是其优良的表型性状，为了能让两者的优良性状更好地结合遗传，必须考虑两者之间的遗传距离，确定其亲缘关系[6]。传统的育种方法主要是利用表型确定亲本之间的亲缘关系，由于子莲的一些重要农艺性状遗传能力相对来说会比较弱，或者极易受到环境等因素的影响，所以这种方法育种的效率不高[7]。

近年来，随着分子生物技术的迅速发展，利用RAPD、SRAP、AFLP、ISSR、基因组SSR等分子标记进行莲种质资源遗传多样性分析及亲缘关系鉴定的研究越来越多。吴景栋等[8]在2011年采用14对RAPD有效引物对30份莲种质资源进行PCR扩增,结果表明花莲与子莲的相似遗传系数较高。欧阳冬梅等[9]在2013 年开发了 11对SRAP引物对40份莲材料进行扩增，扩增出多态性条带 127 条,多态性频率为69.0%，表明莲属具有丰富的遗传多样性。杨美等[10]在2011年利用AFLP分子标记，对395份花莲原始种质进行了DNA多态性分析。刘艺平等[11]在2013年用筛选出的5条ISSR引物分别对6份野生半野生荷花品系和27份荷花栽培品种材料基因组DNA进行扩增,分析出野生半野生品系的各项参数值均低于栽培品种。分子标记由于受环境因素影响小，且数量多，因而可以快速鉴别亲本之间的亲缘关系，在育种筛选亲本的过程中节省大量的人力、物力和时间。

EST-SSR标记除了具有多等位性、共显性、高稳定性等特点外，还可以在近缘种甚至远缘种间通用，这不仅节约合成引物的成本，还使物种间比较谱图的绘制和图谱的整合更为便捷[12]。徐玉仙等[13]在2015年利用EST-SSR分子标记对30个亚洲莲、6个美洲莲及14个亚美杂交莲品种进行遗传多样性分析，发现亚洲莲与美洲莲杂交育成的后代品种与亚洲莲品种的亲缘关系比较接近。本研究采用EST-SSR技术，利用筛选的24对引物对浙江省金华市农业科学研究院国家水生蔬菜育种创新基地保存的19份子莲品种进行遗传多样性分析，了解其亲缘关系，为子莲的种质资源保存及定向育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

材料为金华市农科院水生蔬菜种质资源圃内的19个子莲品种(见表1)，栽培情况良好，管理水平相当，叶片稀疏、长势一致。

1.2 DNA提取

称取子莲新鲜幼嫩叶片80 mg，参照徐玉仙[13]的DNA提取试剂盒法，提取后-20 ℃下长期保存。

1.3 PCR反应体系

PCR反应体系如下：

PCR扩增反应体积为10.0 μL，其中包括2×ES Taqmix 5.0 μL；DNA模板1.0 μL；引物(浓度10 μmol/L)0.5 μL；ddH2O 3.5 μL。

PCR扩增反应程序如下：

94 ℃预变性3 min，然后进入循环，94 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环，最后72 ℃延伸5 min，温度降到4 ℃即完成扩增并保存。

上述PCR产物首先经1.0%琼脂糖凝胶预检测，然后向PCR产物中加入6 μL变性剂94 ℃变性5 min，立即放于冰上冷却，冷却后直接跑胶或-20 ℃保存备用。

1.4 数据统计分析

根据聚丙烯酞胺电泳的结果，相同片段大小的条带记为一个标记等位基因，有带为1，无带为0，缺失为2。在19份子莲材料中统计EST-SSR位点的等位基因变异，将统计的数据输入电脑，根据以下公式计算每对引物的多态性信息含量(PIC)值：

式中，n表示等位基因总数，qi和qj分别为第i和第j个等位基因的频率。

利用NTSYS-pc Version 2.10软件计算所有材料间的遗传相似性系数，基于这些遗传相似性系数用非加权平均法(Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic means,UPGMA)构建聚类树系图。

2 结果与分析

2.1 DNA提取结果

DNA琼脂糖凝胶电泳检测结果见图1。DNA主带清晰、完整，弥散较少，符合SSR对DNA的要求。

图1 部分DNA的电泳检测结果

核酸测定仪检测稀释50倍的DNA样品，读取DNA浓度值(表2)。A260/A280值多数大于1.8，在2.0左右，DNA纯度较高，符合SSR分析的需要。

表2 稀释50倍DNA浓度

2.2 EST-SSR多态性分析

从80对多态性EST-SSR引物中进一步获得24对稳定扩增、高多态性的引物对19份子莲品种进行遗传多样性分析(见图2)。利用优化后的反应体系对24对EST-SSR引物进行扩增筛选。结果显示，24对引物扩增结果清晰明亮，多态性条带丰富，适合对19个子莲品种进行EST-SSR-PCR扩增。多态性信息量(PIC)可用来评估每对引物标记的多态性信息量水平(高：PIC>0.5；适中：0.5>PIC>0.25；低：PIC<0.25)[14]。在本试验筛选的24对EST-SSR引物中，所得PIC值最低的为0.58(NNFB_83)，最高的为0.91(NNFB_1491)，平均每对引物的PIC值为0.77，表明本试验所筛选的24对EST-SSR引物具有较高的多态性，可以对子莲种质资源进行有效的遗传多样性分析。引物信息见表3。

表3 用于遗传性分析的24对EST-SSR引物信息

图2 部分子莲品种的扩增产物电泳图

2.3 基于EST-SSR的遗传多样性分析

根据24对EST-SSR引物的扩增结果，用NTSYS 2.11软件，依据相似系数和非加权组平均法(UPGMA)进行聚类分析，得出19份子莲种质资源的聚类图(图3)。从图3可看出，19份试验的子莲品种的遗传相似系数(GS)范围为0.42～0.94。根据遗传相似系数越小遗传距离越大，其两者之间的亲缘关系就越疏远的理论基础。可以看出本试验所提供的19个子莲品种之间差异明显，具有较丰富的遗传多样性。依据图3，发现在相似系数为0.55处时，所供试材料被分为4组，第Ⅰ组有7个，分别是建选6号、处州白莲、红花建莲、建选10号、建选30号、建选2号和建选17号。第Ⅱ组只有建选35号一个品种。第Ⅲ组有4个，分别是太空5号、满天星、太空3号、京广1号。第Ⅳ组则分别是金芙蓉1号、星空牡丹、宣莲、太空36号、XS-4、初平芙蓉和湘莲。

图3 子莲种质资源的聚类树图

3 讨 论

本实验把供试的子莲分为4组，其中红花建莲和4个建选系的品种都分在了第Ⅰ组里，红花建莲作为建宁的地方品种很可能是建选系列的亲本材料，这与建选系列的选育过程相吻合[15]，同时发现处州白莲与红花建莲的相似系数为0.99，且他们的农艺学性状也没有太大的差别，分布地域也相邻。因此，推测这两个品种很有可能是同一个品种，由于地域的不同被分别命名，成为地方品种。还有一种可能就是因为两地相邻，资源圃在引种时发生串种，引到的都是同一个品种。第Ⅱ组只有建选35号一个品种，它与其他子莲品种的遗传距离都比较大，相对靠近红花建莲，这与建选35号是红花建莲和太空莲20号的杂交后代相符合[16]。第Ⅲ组有4个，分别是太空5号、满天星、太空3号、京广1号。太空3号和太空5号都是由谢克强等[17]选育出的新品种，而京广1号是由太空3号采用离子注入法选育出来的子莲品种，其亲缘关系符合现有结论[18]。第Ⅳ组则分别是金芙蓉1号、星空牡丹、宣莲、太空36号、XS-4、初平芙蓉和湘莲，金芙蓉是以星空牡丹为亲本选育出来的，其两者在一个亚群里。太空36号与湘莲的遗传距离比较近，而太空36号是通过子莲卫星搭载、太空诱变选育而来，所以其可能是湘莲太空诱变的后代。

大多数分子标记方法可以有效地把莲种质资源分为藕莲、子莲和花莲三大类，但在细分遗传距离较近的种质资源时，不同方法会有差异。例如本实验结果在太空36号和星空牡丹的分类上与欧阳冬梅等[9]利用SRAP构建莲指纹图谱的结论一致，但在建选17号的分类上，SRAP表明其与红花建莲相距较远，而EST-SSR揭示其与红花建莲相近，两者有较大差异，同时在京广1号的分类上也存在差异。本实验结果与汪雪芹[19]利用SSR做的子莲遗传多样性的分析结果相近。说明利用EST-SSR标记技术对遗传距离较近的种质资源遗传多样性分析是可行的[20]，子莲基本上都是异花授粉，不同品种之间的基因很容易通过虫媒进行交流，造成了品种间遗传资源的混合和品种内遗传较大的差异，即使同一区域内的不同品种也会有较大的差异[21]。通过EST-SSR分子标记可以有效解决子莲种质资源混乱、遗传背景不清晰和亲缘关系等问题，为今后子莲的种质资源保存及定向育种提供理论基础。