基于光合和荧光参数探讨不同水稻品种苗期耐寒性差异

程 露， 职铭阳， 吴 迪， 陆劲羽， 项 阳， 郑晓明， 逄洪波

(1.沈阳师范大学生命科学学院， 辽宁 沈阳 110034；2.中国农业科学院作物科学研究所， 北京 100081)

水稻是人类生活中必不可少的粮食作物之一，世界上超过50%的人口以水稻为食[1]。全球种植水稻的国家大多数都遭遇过严重的冷害问题[2-4]。我国平均每五年就有一次大规模的低温，因冷害问题导致我国水稻年产量减少30亿～50亿kg[5]。近年来，由于全球变暖和温室效应的不断累积，导致极端恶劣天气出现的次数和规模不断增大，因低温造成的粮食减产问题愈加严重，给我国的粮食安全、经济发展和国计民生带来许多不利影响。

有关水稻低温冷害的研究已有不少报道，低温胁迫会不可逆转地破坏水稻的整个生理和代谢过程，不仅对水稻的外部形态(如发育速度缓慢；株高、叶面积、群体生产力下降；生殖器官受损、空秕率增多等)造成严重的影响[6-7]，同时也会引起一系列生理生化指标(如叶绿素含量下降；丙二醛含量增高；相对电导率、可溶性糖以及其他代谢物含量增高等)的变化[8-11]。

光合作用是评价植物生长质量的重要依据，叶绿素含量对作物的产量有着巨大的影响[12]，作物产量大约 95% 是由叶绿素含量决定的。叶绿体的结构受到冷害胁迫时极易被破坏，叶绿体蛋白变性、叶绿素合成量减少、叶片颜色褪绿、植株黄化、同时光合同化能力下降，植株生长迟缓，产量与质量下降[13]。光系统是植物低温胁迫下首先受到伤害的组织，其中光合系统Ⅱ(PSⅡ)在植物光合作用的光反应过程中发挥着巨大的作用，影响光合作用中电子传递和光能转化效率[14-15]。低温条件下，PSⅡ结构受损，光化学活性受抑制，光能转化效率降低。叶绿素荧光参与光合作用中的各个过程，当光合作用中某一点发生变化时，叶绿素荧光则会发生改变，因此可以将叶绿素荧光作为探究植物光合作用的探针，并将叶绿素含量和叶绿素荧光参数的大小视为植物耐受逆境的生理指标[16]。叶绿素荧光参数主要包括：暗适应初始荧光F0、暗适应最大荧光Fm、暗适应最大可变荧光Fv、最大光化学效率Fv/Fm、PSⅡ潜在活性Fv/F0等。

培育耐寒品种是解决冷害问题最直接的手段。王晨光等[17]以黑龙江省监狱局水稻所提供的3个水稻品种为材料，分析其叶绿素含量、根系活力等4个生理指标的变化，鉴定出1个耐寒性较强的品种；王兰等[18]以叶绿素含量为评价指标，从84份水稻品种中初步筛选出13份苗期耐寒材料；周新桥等[7]以植株的外部形态和死亡率作为评价指标，从南方稻区初步筛选出的18份水稻品种中鉴定出6份耐寒性较强的材料；丁国华等[19]利用自然低温胁迫鉴定了130份耐寒性较好的材料。

本研究以30个水稻品种作为研究对象，测定低温胁迫前后及一段恢复期内的叶绿素含量、Fv/Fm值及Fv/F0值的变化，进而对水稻种质资源的苗期耐寒性进行筛选和鉴定，以期为水稻抗寒品种选育及耐寒分子育种提供中间材料。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验所用的30个水稻品种均由中国农业科学院作物科学研究所提供，具体品种信息详见表1。

表1 用于本实验水稻品种详细信息

1.2 材料的处理

种子放于 50 ℃ 培养箱处理 72 h 打破休眠后，营养土中播种，置于培养室(30 ℃，光照12 h/黑暗12 h)生长至14 d三叶一心期后，放入人工气候培养箱(15 ℃，光照12 h/黑暗12 h)48 h后，放回培养室恢复生长。

1.3 生理指标的测定

实验共选取处理前(T1)、15 ℃ 胁迫2 d(T2)、培养室恢复生长1 d(T3)、恢复生长3 d(T4)和恢复生长5 d(T5)这5个时间点进行叶绿素含量、Fv/Fm值及Fv/F0值的测定，每个指标重复测定3次。

1.3.1叶绿素含量的测定

采用 SPAD-502 Plus 叶绿素仪(浙江托普仪器公司)进行测定。

1.3.2光合指标的测定

采用pocket PEA 便携式荧光仪(英国Hansatech公司)进行测定。

1.4 数据处理

使用Excel 2013软件计算其平均值和标准方差。利用基迪奥平台(http://www.omicshare.com/tools)，采用STEM软件的原理，绘制箱线图及趋势分析图。直接采用数据标准化处理后的值(T1～T1，T2～T1，T3～T1…)做趋势分析，显著性设置为默认值(p<0.05)。

2 结果与分析

2.1 不同水稻品种在低温胁迫下叶绿素含量的变化

为了观察不同水稻品种在低温胁迫条件下叶绿素含量的变化，试验对5个时间点的叶绿素含量进行了分析，结果如图1所示，低温胁迫前，粳稻叶绿素含量普遍高于籼稻；粳稻在受低温胁迫时，叶片叶绿素含量虽然出现小幅下降，但在恢复生长后出现回升，走势相对平稳，说明粳稻在受低温胁迫时恢复力较好；而籼稻在受低温胁迫时，叶绿素含量呈明显的下降趋势。整体上，籼稻的叶绿素含量变化受低温影响较大，说明粳稻的耐寒能力强于籼稻。

图1 低温处理前后粳稻与籼稻叶绿素含量箱线图

为了进一步观察粳稻各个品种间的差异，试验对16个粳稻品种5个时间点的叶绿素含量变化进行了趋势分析(图2)。从图2可以看出，粳稻叶绿素含量变化的趋势分为3种。A趋势4个品种(z 973、z 1076、z 1114和z 1094)的叶绿素含量在低温胁迫前后5个时间点内一直呈现下降趋势，下降值高达4，相较于未处理前存在显著差异(p<0.05)，说明这4个粳稻品种耐寒性较差。B趋势的6个品种(z 947、z 955、z 969、z 1034、z 1083和z 1107)在低温胁迫2 d及恢复生长1 d内，叶绿素含量下降幅度较小，相较于未处理前不存在显著差异；恢复生长3 d后，不同品种叶绿素含量回升的幅度不一样，说明各品种耐寒性存在差异；恢复生长5 d 后，B趋势的6个品种的叶绿素含量恢复到未处理前水平。C趋势包含6个品种，分别为z 931、z 976、z 984、z 1001、z 1049 和z 1080，其在低温胁迫2 d内，叶绿素含量下降较小；恢复生长1 d内叶绿素含量无明显变化；恢复生长3 d内，叶绿素含量出现不同程度的回升；恢复生长5 d后，叶绿素含量出现小范围下降。从叶绿素含量变化趋势可以初步筛选出粳稻中除了A趋势4个品种外，其余品种的耐寒性相对较好。

注：红色实线表示模拟差值所做的模拟趋势图，灰色细线表示不同水稻品种的实际趋势图。

与粳稻相比，14个籼稻品种在低温胁迫前后5个时间点其叶绿素含量变化趋势相对比较简单，只有两个趋势(图3)。A趋势包含了13个品种，分别为z 930、z 939、z 940、z 945、z 953、z 992、z 1020、z 1048、z 1054、z 1056、z 1057、z 1075和z 1118，其叶绿素含量在低温处理前后5个时间点一直在大幅下降，且相较于未处理前存在显著差异，说明绝大部分籼稻品种对低温敏感，耐寒性较差。B趋势仅包含z 1082一个品种，其叶绿素含量在低温胁迫2 d内，下降幅度较少；并且在恢复生长3 d内，叶绿素含量出现回升；恢复生长5 d后，虽然叶绿素含量出现小幅下降，但较未处理前下降较小，说明该籼稻品种较绝大多数籼稻而言，为较好的耐寒品种。总体上看，叶绿素含量变化范围较大，呈明显的下降趋势；但个别品种(B趋势品种)的叶绿素含量较未处理前差异较小，为较好的耐寒品种。

注：红色实线表示模拟差值所做的模拟趋势图，灰色细线表示不同水稻品种的实际趋势图。

2.2 低温处理对不同水稻品种Fv/Fm 值的影响

图4是30个水稻品种的PSⅡ原初光能转化效率(Fv/Fm)结果，从图4可以看出，不同水稻品种其幼苗叶片间的Fv/Fm值在未受到低温伤害前不存在显著差异，均在0.80～0.82之间。15 ℃放置2 d后，粳稻与籼稻品种Fv/Fm值均出现降低现象，每个品种下降的程度各不相同，总体上看籼稻下降幅度更大。恢复生长后，粳稻与籼稻的Fv/Fm值均表现出不同幅度的上升现象，且粳稻恢复水平更快。由于各水稻品种在低温处理前后其Fv/Fm值保持在0.75～0.83之间，相差很小，无法很好地反映出其显著变化趋势，故不做分析。

图4 低温处理前后粳稻与籼稻Fv/Fm值箱线图

2.3 低温处理对不同水稻品种Fv/F0值的影响

图5是30个水稻品种的Fv/F0值在低温胁迫前后5个时间点的测定结果。未受到低温伤害前，各品种的Fv/F0值均保持在0.40～0.45之间，无显著差异。低温处理2 d后，粳稻与籼稻的Fv/F0值均出现下降现象，总体上籼稻下降幅度较大。恢复生长一段时间后，粳稻与籼稻的Fv/F0值均表现出不同程度的回升现象，且粳稻回升更快，说明粳稻恢复力更强。

图5 低温处理前后粳稻与籼稻Fv/F0值箱线图

为了进一步观察粳稻各个品种间的差异，对16个粳稻品种5个时间点的Fv/F0值进行了趋势分析，变化趋势大致分为4种(见图6)。A趋势仅包含z 1094一个品种，其Fv/F0值在低温胁迫后一直呈现下降趋势，且恢复5 d后其Fv/F0值相较于处理前存在显著差异，说明该粳稻品种受温度影响较大，耐寒性较差，为冷敏感型品种。B趋势2个品种(z 969和z 984)在低温胁迫至恢复1 d内，Fv/F0值出现小范围的下降后；恢复生长1 d后，出现不同程度的回升现象，特别是最初下降幅度大的品种，其涨幅迅速，说明受伤害后恢复较好。恢复生长5 d后，基本恢复到进行低温胁迫前的水平，说明植株已经恢复正常生长。C趋势2个品种(z 1034和z 1107)的Fv/F0值，在低温处理2 d后下降范围较小，与处理前不存在显著差异。恢复生长1 d后，出现不同程度短暂上升的现象。恢复生长3 d后，其Fv/Fm值均再次出现下降趋势，范围较小。恢复生长5 d后，其Fv/Fm值较未处理前差异不显著。D趋势包含11个品种，分别为z 931、z 947、z 955、z 973、z 976、z 1001、z 1049、z 1076、z 1080、z 1083和z 1114，呈W状走势，即在低温处理2 d内，其Fv/Fm值下降范围较小，且在恢复生长1 d内均出现不同程度的短暂回升现象；虽然恢复生长3 d内均再次出现短暂小幅下降，但恢复生长5 d后其比值与未处理前无明显差异，甚至个别品种其比值高于对照。通过低温前后各品种Fv/F0值变化的趋势图，初步得出粳稻中除了A趋势1个品种外，其余品种耐寒性较好。且Fv/Fm值的变化趋势与叶绿素含量的变化基本一致。

注：红色实线表示模拟差值所做的模拟趋势图，灰色细线表示不同水稻品种的实际趋势图。

进一步对14个籼稻品种在低温胁迫前后5个时间点的Fv/F0值变化进行趋势分析(图7)。A趋势仅有z 1020 一个品种的Fv/F0值在低温处理前后5个时间点内一直大幅下降，极值达到4，说明该籼稻品种极易受温度的影响，为极不耐寒品种。B趋势含有1个品种(z 1082)，尽管在低温胁迫至恢复1 d内，Fv/F0值显著下降，但在恢复生长1 d后迅速上升，且恢复生长5 d后其Fv/F0值恢复至对照水平，说明该品种低温胁迫后恢复速度快，相较于绝大多数籼稻而言，为较好的耐寒品种。C趋势z 940在低温胁迫2 d内，Fv/F0值大幅下降，虽然恢复生长1 d后，出现短暂回升现象，但在恢复生长5 d后，其Fv/F0值相较于未处理前仍存在显著差异，为不耐寒品种。D趋势的11个品种(z 930、z 939、z 945、z 953、z 992、z 1048、z 1054、z 1056、z 1057、z 1075和z 1118)整体呈W走势，即低温处理2 d内，Fv/F0值下降程度较大，最大下降1.5；恢复生长1 d内，Fv/F0值均出现短暂上升现象，上升的幅度各不相同；恢复生长3 d内，再次出现短暂下降，恢复生长5 d后，绝大多数品种的Fv/F0值仍低于冷处理前，说明恢复速度慢，耐寒性较差。通过低温前后各品种Fv/F0值变化的趋势图，可以得出籼稻中除了B趋势1个品种外，其余品种耐寒性较差。

注：红色实线表示模拟差值所做的模拟趋势图，灰色细线表示不同水稻品种的实际趋势图。

3 讨 论

目前，有关水稻苗期耐寒性筛选鉴定的研究主要根据外部形态特征以及生理生化指标两方面开展[7]。光合作用是植物维持机体正常生命活动的必要生物过程，通过植物光合作用强弱可以判断其生长的好坏。叶绿素在光吸收中发挥着巨大的作用，叶绿素的含量直接影响了植株的光合效率和产量[12]。在一定范围内，植物体叶绿素含量越高，生物学产量越高[18]。当植物受到冷害胁迫时，叶绿体结构受破坏，叶绿素合成降低，光合作用受抑制，进而导致光合系统Ⅱ(PSⅡ)活动受抑制，可能是光合作用的降低引起PSⅡ的潜在活性Fv/F0的下降，抑制了原初光能反应过程，使得PSⅡ无法正常传递电子，导致最大光化学效率Fv/Fm的下降。王国莉等[20]以光合速率和叶绿素荧光参数为评价指标，比较低温对水稻耐冷品种和冷敏感品种二者之间的影响。本研究以叶绿素含量以及荧光参数Fv/Fm值和Fv/F0值作为水稻苗期耐寒性的鉴定评价指标，研究结果表明，不同品种的水稻幼苗在低温胁迫条件下，其叶绿素含量、Fv/Fm值和Fv/F0值下降程度呈现出明显的差别，叶绿素含量、Fv/Fm值和Fv/F0值的下降程度均与水稻品种的耐寒性呈明显的反比关系；随着温度恢复升高，三者均出现不同程度的回升现象。因此，叶绿素含量以及荧光参数Fv/Fm值和Fv/F0值可以作为低温胁迫条件鉴定水稻苗期耐寒性的生理指标。

以往的研究结果表明，栽培稻的两个亚种在漫长的人工驯化和进化过程中逐渐适应各自的生存环境，粳稻生长在温带及低纬度地区，籼稻生长在热带及亚热带地区，故粳稻的耐寒性普遍强于籼稻[21-22]。本研究测定了30个水稻品种低温前后的叶绿素含量、Fv/Fm值及Fv/F0值的变化，结果显示粳稻的耐寒性普遍强于籼稻，与前人的结果相一致。同时发现粳稻个别品种，如z 973、z 1076、z 1094和z 1114在受低温胁迫时，叶绿素含量下降量较大，甚至在恢复生长后叶绿素含量较未处理前仍存在较大差异，说明粳稻中也存在低温敏感品种。而籼稻品种如z 1082在受到冷害时，叶绿素含量下降程度较小，能够正常合成叶绿素，属于较好的耐寒品种。南方水稻种植区为了提高种植产量，经常会选择一些苗期耐寒性强的早籼稻，故水稻品种的耐寒性不仅由遗传背景决定，还与其地理分布及当地的种植策略相关。本研究根据低温胁迫下叶绿素含量、Fv/Fm值及Fv/F0值的变化，初步筛选出苗期耐寒性较强的水稻种质资源13份，分别为黑龙江省的z 976、z 984、z 1034、z 1080和z 1001，辽宁省的z 969和z 1107，吉林省的z 931和z 944，云南省的z 1083，北京市的z 947，广东省的z 1082及日本的z 1049。

综上所述，本研究通过生理指标对30个水稻品种的苗期耐寒性进行鉴定评价。结果表明，低温影响水稻生长发育中叶绿素的合成，且对不同水稻品种的影响程度不一，总体上粳稻耐寒性好于籼稻。本研究以叶绿素含量、Fv/Fm值及Fv/F0值可以很好的区分各个品种的苗期耐寒性，并初步筛选出苗期耐寒性较强的水稻种质资源13份，研究结果对耐寒水稻种质的选育及耐寒后续基因挖掘及功能验证具有一定的参考意义。