不同B细胞亚群在多发性硬化中的作用①

孙美丽 李呼伦（哈尔滨医科大学神经生物学教研室，哈尔滨 150081）

多发性硬化（multiple sclerosis，MS）是青少年神经功能障碍最常见的原因之一，其特征是持续的炎症，脱髓鞘和对中枢神经系统（central nervous system，CNS）不可修复的损伤［1-2］。MS经典临床分型包括复发缓解型多发性硬化症（relapsing remitting multiple sclerosis，RRMS）、继发进展型多发性硬化症（secondary progressive multiple sclerosis，SPMS）和原发进展型多发性硬化症（primary progressive multiple sclerosis，PPMS）［3］。其中以RRMS最为常见。MS的实验动物模型和MS 患者是其主要的研究对象。实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encepha⁃lomyelitis，EAE）是RRMS 的公认实验模型［4］，而泰勒氏鼠脑脊髓炎病毒（TMEV）感染是进行性MS 的公认实验模型［5］。MS 病因尚不清楚，其具有遗传复杂性，被认为是环境（例如：低水平的维生素D、感染EB病毒、吸烟和过早肥胖）-遗传相互作用的结果［6］。全基因组关联研究MS的200多个遗传风险变异，其中许多编码了参与免疫系统反应的分子［7］，支持了MS 主要是一种免疫介导性疾病的流行概念。已知固有免疫系统和适应性免疫系统及其效应细胞（如B 淋巴细胞、T 淋巴细胞、活化的小胶质细胞和巨噬细胞）会影响MS 的发病机制［2］，且T 细胞已被普遍认为是MS 免疫病理机制和CNS 定向自身免疫调节的核心［8-9］。其中CD4+T 细胞、CD8+T 细胞和γδT 细胞在MS的发病机制中发挥相应作用，尤其是CD4+T细胞［10-13］。已知调节性T 细胞（Treg）和CNS 反应性效应T细胞（Teff）之间的平衡失调是MS新发病的基础，并且纠正这种平衡失调对MS 具有治疗效果［14-15］。但在临床上针对CD4+T 细胞靶向治疗MS并没有达到预期效果［16-22］。因此，可能存在其他因素参与MS 发病机制。值得注意的是，抗CD20 治疗MS 显著有效的结果突出了B 细胞在新的疾病攻击中的中心作用，包括呈递抗原、分泌细胞因子和产生抗体［14，23-24］。同时也证实在MS中B 细胞对CD4+T细胞和CD8+T 细胞存在调控作用，但与γδT 细胞的关系还鲜有报道，这值得进一步探索。但随着在MS中B 细胞耗竭治疗（B cell depletion therapy，BCDT）的进行，其副作用问题也渐渐凸显出来，且在MS 的动物模型EAE 发病早期和高峰期过程中，BCDT 的应用分别出现加剧和抑制疾病症状的不同状态［25-27］。存在这些现象的原因可能是在EAE 免疫病理过程中存在不同的B细亚群所致。目前，在MS中根据起源和功能对B 细胞进行分类具有相应的报道，但在发育过程中对B 细胞的分类还鲜有报道［14，28-29］。B 细胞发育过程中的调节异常会导致自身免疫性疾病的发生［30］。本课题组认为对MS 患者不同发育阶段的B 细胞进行研究将为深入探讨MS发病机制和临床治疗策略提供新思路。因此，本文将从B 细胞发育过程中不同的B 细胞亚群在MS 发病过程中的作用进行描述。

1 不同B细胞亚群在MS发病过程中的作用

为了更好地了解不同B 细胞亚群在MS 免疫病理过程中的作用，课题组首先总结了B 细胞的发育过程（图1）。B 细胞最早可分为B1 和B2 两个亚群，通常所说的B 细胞都是后天发育成熟的，统称为B2细胞。只有成熟的B细胞才能进入脾脏和淋巴结的淋巴滤泡，从而有效参与免疫应答。为了完成发育，骨髓中未成熟的B 细胞作为过渡性B 细胞（tran⁃sitional B cells）迁移到脾脏经历T1 B 细胞和T2 B 细胞两个过渡阶段［31］。在进入外周免疫器官之前，未成熟的B 细胞进行负选择防止自身反应性的B 细胞进入外周免疫器官［32］。脾脏中过渡性B 细胞通过B细胞受体（B cell receptor，BCR）和其他受体接收的信号分化为边缘区（marginal zone，MZ）B 细胞或滤泡（follicular，FO）B 细胞［33］。MZ B 细胞和FO B 细胞在外周淋巴组织经历T 细胞依赖性抗原（TD-Ag）或T 细胞非依赖性抗原（TI-Ag）激活后分化为浆母细胞、浆细胞和记忆B 细胞参与体液免疫反应［34］。而一种先天发育成熟的特殊B 细胞称为B1细胞，不同于B2 细胞的发育途径，在无刺激和优先接受TI-Ag激活后分别产生天然免疫球蛋白M（IgM）和后天IgM［35］。B1细胞是具有自我更新能力的CD5+的B细胞，主要来自腹膜腔和胸膜腔，是天然IgM 分泌的主要来源，并参与固有免疫反应［35-36］。值得注意的是，有证据表明几乎所有的B细胞亚型都可以通过涉及炎症信号和BCR 识别的机制分化为调节性B 细胞（Breg）［37］。

图1 B细胞的发育过程Fig.1 Process of B cell development

1.1 过渡性B细胞在MS免疫病理过程中的作用过渡性B细胞过渡性发育阶段是人体对自身反应性B 细胞存活与凋亡的关键选择点。共刺激分子CD40、BAFF-R、TACI 和TLRs 可能在表达自身免疫BCR 的过渡性B 细胞发育为成熟的幼稚B 细胞的过程中发挥积极作用［38］。KLHL6 基因缺陷有利于过渡性B 细胞存活和分化为成熟的幼稚B 细胞，为自身免疫性疾病的治疗提供了新的理论基础［39］。在自身免疫性疾病系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）和干燥综合征（Sjögren syndrome，SS）患者血液中，B 细胞稳态失调（主要包括过渡性B 细胞增多）导致各种器官功能障碍［40］。在放射学孤立综合征（RIS）和临床孤立综合征（CIS）中，过渡性B 细胞亚群比例改变［41］。以上说明过渡性B 细胞在自身免疫性疾病过程中发挥重要作用。因此，自身反应性过渡性B 细胞的清除可能为MS 或自身免疫性疾病治疗的对策。

此外，CIS和RRMS患者外周血中的过渡性B 细胞减少，但CD80 阳性活化状态的过渡性B 细胞增加，同时在脑脊液（CSF）中发现存在过渡性B 细胞［42］。在CIS 和MS 患者体内，过渡性B 细胞中整合素α4 和β1 链表达均升高（仅MS 患者α4 链的升高没有统计学意义）［42-43］，说明过渡性B 细胞高表达CD80 和黏附分子的特殊状态可能是其穿越血脑屏障的必备条件，是MS 疾病早期阶段的一个特征。基于此开发的抗VLA-4 抗体Natalizumab 阻断整合素α4β1 已被保留用于高度活跃的RRMS 患者［44］。因此寻找抑制整合素α4、β1或CD80的方法可能是抑制过渡性B细胞进入早期MS患者CNS和分化为自身反应性成熟的幼稚B细胞治疗MS的另一重要方向。

相反，在EAE 中过渡性B 细胞能作为Breg 产生IL-10 发挥其调节作用［45-46］。未来在充分理解自身免疫性过渡性B细胞存活与凋亡的具体信号通路和过渡性B细胞发育调节机制及其迁移和逃逸途径的基础上，研发过渡性B细胞清除和阻碍迁移的药物可能是治疗MS或其他自身免疫性疾病的重要策略。

1.2 滤泡B细胞在MS免疫病理过程中的作用 淋巴滤泡生发中心是活化的FO B 细胞发生体细胞超突变、类转换重组和亲和力成熟选择分化为记忆性B细胞或分泌高亲和力抗体的浆细胞的微环境［47-48］。有报道称在CNS 自身免疫性疾病慢性炎症条件下，免疫特权较低的脑膜腔室是异位淋巴滤泡优先发育的部位，致病性B 细胞反应可在此维持［49］。MS患者的脑膜中包含带有生发中心的异位淋巴样结构，包括增殖B 细胞、T 细胞和浆细胞以及产生CXCL13的滤泡树突状细胞网络，其形成可能是维持体液自身免疫和疾病恶化的关键步骤［50-51］。SPMS 患者软脑膜的蛛网膜下腔中，滤泡样结构与皮质脱髓鞘增加、神经元丢失、脑膜浸润和CNS 炎症以及发展为严重残疾和死亡有关［52］。综上说明，FO B 细胞在活化后既可分化为产生抗体的浆细胞参与适应性体液免疫应答，又能作为成熟B 细胞发挥抗体非依赖性功能。因此，深入了解FO B细胞向浆细胞分化的机制和作为成熟B 细胞发挥的功能可能有助于MS或自身免疫性疾病发病机制的解析和治疗对策的研究。转录因子B 淋巴细胞诱导成熟蛋白1（Blimp1）在协调浆细胞分化中发挥多种功能［53］。激活的B 细胞的增殖需要促进Blimp1 表达，但需要终止增殖以避免过度的免疫反应［54］。B 细胞特异性激活蛋白1（AP-1）转录因子Fra1缺失的小鼠体内浆细胞分化和抗体反应增加，证实Fra1 通过抑制Blimp1的表达来抑制浆细胞分化［54］。目前还没有相关报道阐明Fral对MS或其他自身免疫性疾病的影响，值得进一步探索。

1.3 浆母细胞和浆细胞在MS 免疫病理过程中的作用 在RRMS 中，外周血滤泡辅助性T 细胞（TfH）与滤泡调节性T 细胞（Tfr）比值（TfH/Tfr）增加，且与血液和CSF 中的异常IgG 产生相关，表明源自外周生发中心反应失调的抗体产生细胞（浆母细胞/浆细胞）在CNS 上定殖［55］。除了产生抗体，在小鼠中浆母细胞/浆细胞是产生细胞因子IL-10、IL-35、TNF-α、IL-17 和GM-CSF 的活化B 细胞的主要类型，表明存在不同的浆母细胞/浆细胞亚群，这些亚群可通过细胞因子的表达模式来区分［56］。此外，在EAE 中浆细胞通过IL-10、IL-35细胞因子的产生调节免疫［56］。

1.4 记忆B细胞在MS免疫病理过程中的作用 在MS 中，自身反应性B 细胞逃避了外周选择，并可能在次级淋巴器官淋巴滤泡内分化为记忆群，然后进入CNS［57-58］。与外周血相比，MS 患者CNS 记忆B 细胞显著升高［59］。MS 患者CSF 中存在的寡克隆区带（OCB）提示这些记忆B 细胞在局部发生反应从而再活化，进一步发展为产生免疫球蛋白（Ig）的记忆细胞或浆细胞［50］。Atacicept（阿塞西普）可增强记忆B 细胞反应，并促使MS 复发，说明记忆B 细胞在复发性MS 中至关重要［60］，同时临床上Atacicept 的应用带来疾病的复发值得进一步关注。在MS 中记忆B细胞接受BCR和CD40刺激后分泌LT和TNF-α［61］。MS 患者的记忆B 细胞能有效地向T 细胞呈递神经抗原，激活T 细胞［62-63］。有报道指出，在MS 患者不同的CNS 隔室中选择性富集CXCR3+IgG1+记忆B 细胞，并且IFN-γ 和TLR9 信号能触发该细胞群分化［64］，因此，确定MS 患者CNS 这些记忆细胞群特点，并寻找能够调节它们形成，进行招募和局部反应性的外界因素并加以抑制可能有效缓解MS 的病理变化。B 细胞淋巴瘤-6蛋白（Bcl-6）对记忆B 细胞的生成和维持其更新的能力是必需的［65-66］。此外，TfH分化受Bcl-6调控，且TfH调节异常与自身免疫性疾病SLE、MS 和类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）有关［67-68］。已有报道指出Bcl-6可通过调控Tfr和巨噬细胞活性来影响自身免疫的发生与发展［69-70］。目前尚无Bcl-6通过记忆B细胞对MS或其他自身免疫性疾病影响的相关报道，值得进一步探索。

1.5 B1 细胞与MZ B 细胞在MS 免疫病理过程中可能存在的作用 尽管B1细胞与MZ B细胞的发育关系尚不明确，二者可能来源于不同的谱系，但二者在某些功能上似乎有相同的作用［71-73］。B1 细胞与MZ B 细胞能够通过TLR 快速对脂多糖刺激进行反应，并分化为短寿命的浆母细胞，产生大量的IgM 及同型转换抗体，这些与生俱来的淋巴细胞的特殊功能弥补了早期固有免疫反应和较慢的适应性抗体反应之间的差距［74］。

在B 细胞非依赖性EAE 中，IFN-β 改善了神经炎症，而在依赖B 细胞的EAE 中，IFN-β 对疾病没有影响，且在两种EAE 模型中，IFN-β 均增加了MZ B细胞［75］，这些发现表明增加的MZ B 细胞可能影响EAE 中IFN-β 的功效。MZB1 是B 细胞特异性ER 分子伴侣复合物的一部分，在MZ B 细胞和B1 细胞中高表达，能调节成熟IgM 的适当组装和分泌［76-77］。在自身免疫性疾病SLE 患者淋巴结和RA 患者滑膜组织标本中的MZB1+MZ B 细胞增加，因此MZB1 可能是SLE 和RA 潜在的治疗靶标［78］。在MS 中MZB1是否存在异常和是否能够作为潜在的治疗靶标值得进一步探索。

MS 患者的脑脊液中表达CD5 的B 细胞增加并且具有致病作用，RRMS 患者的外周血中B1 细胞亚群减少［79-80］。这些现象表明MS 患者外周血B1 细胞可能进入CNS 后影响疾病病理变化。先天性反应激活剂IRA-B细胞（来源于B1a细胞）产生的GM-CSF能加速病原体的清除，预防败血性休克［81］。在动脉粥样硬化中IRA-B 细胞以GM-CSF 依赖的方式激活Th1 适应性免疫进而加重疾病进展［82］。GM-CSF 是罕见的MS 发病机制中必需的细胞因子之一［83］，目前尚无IRA-B 细胞与MS 相关的报道，值得进一步思考。

此外MZ B细胞和B1细胞是脾脏中B细胞IL-10的主要来源［84］。在狼疮小鼠中，TLR-9 激活的MZ B细胞通过分泌IL-10调节T细胞介导的炎症反应［85］。在胶原蛋白诱导性关节炎（collagen-induced arthritis，CIA）（常用的RA 模型）缓解阶段，表达T-bet 的MZ B细胞向CXCR3配体迁移并在炎症刺激后（anti-IgM、CpG 和IFN-γ）分泌IL-10 调节CIA 的缓解［86］。目前激活的MZ B 是否也存在同样的缓解MS 的作用鲜有报道，值得进一步探索。

1.6 Breg 在MS 免疫病理过程中的作用 在慢性炎症疾病（如MS）过程中，免疫系统被持续激活，其特征是Breg 在循环和炎症部位的数量与功能不足［87］。在MS 和其他自身免疫性疾病中，Breg 在抑制疾病活动和发生与发展中发挥重要作用［88］。在MS 中Breg 通过抑制树突状细胞（dendritic cells,DCs）产生促炎细胞因子间接地抑制致病性T 细胞分化［89］；Breg 通过同源相互作用诱导Treg 生成而抑制自身免疫性疾病的发生与发展［90］；此外，Breg 通过分泌细胞因子IL-10、IL-35、TGF-β1 抑制炎症反应［91］。有证据表明，几乎所有的B 细胞亚群都可以通过涉及炎症信号和BCR 识别的机制分化为Breg［37］。MS 的未来研究和治疗策略中，识别诱导B细胞成为Breg 必需的刺激物是一个重要的考虑因素，如TLR 和/或CD40 激活是已知诱导其分化的最有特征的信号［92］。当然不能排除将来可能会发现定义Breg功能的转录调控因子。

综上所述，不同B细胞亚群在MS中的相对贡献存在差异，每种B 细胞亚群同时具有致病作用和保护作用，两种作用失衡可能是导致疾病发展的主要原因。因此，消除或抑制致病性B 细胞亚群或寻找抑制该亚群形成的因素可能对MS具有治疗作用。

2 结语与展望

在MS的发病过程中B细胞发挥重要作用，然而BCDT 存在一定的副作用，这使研究者的关注点集中在B 细胞亚群上。然而不同B 细胞亚群的相对贡献存在差异，是否存在其他对MS有影响的B细胞亚群还未知。目前在MS 中靶向特异B 细胞亚群的治疗方法很少，在临床上，针对不同B细胞亚群开发和应用特异性的靶向致病性B细胞亚群的药物来治疗MS是未来需要解决的重要问题。