S基因突变对慢性乙型肝炎肝硬化患者血清AFP、PTX3表达及预后的影响

秦旭 侯志云 张松 马丽 朝浩鹏

研究表明，慢性乙型肝炎后肝硬化及肝癌的发生与某些基因突变有关[1]。甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)是肝癌诊断中的重要标志物，癌变发生时癌细胞自身可生成AFP[2]。正五聚蛋白3(pentraxin 3，PTX3)对慢性丙型肝炎患者肝纤维化的发生起到重要作用[3]。本研究探讨慢性乙型肝炎肝硬化患者S基因突变与血清AFP、PTX3表达水平的关系，分析S基因突变对患者的影响，以期为不良预后的早期预测提供参考依据。

资料与方法

一、一般资料

选取2017年7月至2019年6月于北京市大兴区人民医院住院治疗的76例慢性乙型肝炎肝硬化患者为研究对象(肝硬化组)，年龄32～68岁；同期选取慢性乙型肝炎患者87例作为对照(肝炎组)，年龄33～70岁。纳入标准：①慢性乙型肝炎、慢性乙型肝炎肝硬化的诊断符合相应指南[4,5]；②病例资料齐全者；③经本院临床研究伦理委员会批准，所有研究对象均为自愿参加；④未进行过放疗、化疗。排除标准：①伴有其他类型病毒性肝炎者；②伴有严重肾功能不全者；③进行过肝移植者；④伴有其他血液系统、自身免疫疾病及恶性肿瘤者。查阅门诊及住院病历，收集患者一般资料，包括性别、年龄、体质量指数(body mass index，BMI)等。

二、主要试剂与仪器

BigDye测序试剂盒购自美国ABI公司；AFP ELISA试剂盒购自上海延慕实业有限公司；PTX3 ELISA试剂盒购自武汉菲恩生物科技有限公司。全自动生化分析仪购自美国贝克曼库尔特公司；实时荧光定量PCR仪购自上海普迪生物科技有限公司。

三、研究方法

(一)样品采集及保存 采集受试者入院第2天晨起空腹静脉血，3000 r/min离心15 min后收集血清，置于-80℃保存待测。

(二)HBV前S区基因突变的检测 采用半套式PCR对HBV S基因编码区进行扩增，将扩增产物用测序试剂盒进行纯化和测序，当HBV DNA高于104 IU/mL时，满足扩增及测序条件。将测序结果用Vector NTI Suite 9.0软件拼接，序列与GenBank数据库的参考序列进行比对分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi)。

(三)血清AFP、PTX3及肝功能指标测定 采用酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法检测血清AFP、PTX3水平，采用全自动生化分析仪检测血清总胆红素(total bilirubin，TBil)、天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、丙氨酸转氨酶(alanine transarninase，ALT)水平，操作按照试剂盒说明书进行。

(四)随访 慢性乙型肝炎肝硬化患者出院12个月内以电话等方式随访，收集了解患者并发症及癌变发生情况，包括肝性脑病、感染、消化道出血、胆结石、电解质紊乱、原发性肝癌，根据是否发生上述事件将慢性乙型肝炎肝硬化患者分为预后良好43例和预后不良33例。

四、统计学分析

结 果

一、肝炎组与肝硬化组一般资料、肝功能指标及S基因突变比较

肝硬化组与肝炎组性别、年龄、BMI比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。肝硬化组TBil水平及S基因突变患者比例高于肝炎组，AST、ALT水平低于肝炎组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

二、慢性乙型肝炎肝硬化患者血清AFP、PTX3表达水平比较

根据S基因是否发生突变将慢性乙型肝炎肝硬化患者分为S基因突变组22例和S基因未突变组54例。S基因突变组血清AFP为(5.98±2.01)ng/mL、PTX3为(5.24±1.43)μg/L，高于S基因未突变组的(4.86±1.34)ng/mL、(3.84±1.05)μg/L，差异有统计学意义(t=2.839、4.729，P<0.05)。

三、S基因突变慢性乙型肝炎肝硬化患者血清AFP、PTX3水平与肝功能指标相关性

Pearson法分析结果显示，S基因突变慢性乙型肝炎肝硬化患者血清中AFP、PTX3水平与TBil均呈正相关(r=0.502、0.479，P=0.004、0.009)，与AST(r=-0.492、-0.513，P=0.007、0.002)、ALT(r=-0.487、-0.494，P=0.006、0.008)均呈负相关。

四、S基因突变与慢性乙型肝炎肝硬化患者预后的相关性

S基因突变与慢性乙型肝炎肝硬化患者预后有关(r=0.553，P<0.05)，且发生S基因突变的慢性乙型肝炎肝硬化患者中预后不良比例高于预后良好(86.36%比13.64%)。

五、影响慢性乙型肝炎肝硬化患者预后的多因素logistic回归分析

将慢性乙型肝炎肝硬化患者是否发生不良预后作为因变量，以S基因突变、AFP、PTX3、AST、ALT、TBil为自变量进行logistic回归分析，结果显示S基因突变、AFP是影响慢性乙型肝炎肝硬化患者发生不良预后的独立危险因素(P<0.05)。见表2。

讨 论

慢性乙型肝炎肝硬化进一步发展可能会出现肝性脑病、电解质紊乱以及肝癌等并发症[6,7]。但慢性乙型肝炎肝硬化发病机制较复杂，以往研究显示S基因突变可能影响慢性乙型肝炎肝硬化的发生、发展，且S基因突变可能与体内血清因子表达有关[8]。因此，探究慢性乙型肝炎肝硬化患者S基因突变与预后的关系，可能对个体化治疗方案的选取及预后改善有重要意义。

金子铮等[9]研究发现，HBV DNA前S区缺失突变检测对肝病进展风险及预后评估有一定价值。本研究结果显示，肝硬化组中S基因突变患者比例高于肝炎组，S基因突变与慢性乙型肝炎肝硬化患者预后有关，是患者发生不良预后的独立危险因素，与上述研究结果基本一致。提示S基因突变可能是导致HBV感染相关肝脏疾病加重的重要因素。AFP主要在胎儿肝脏中合成，是一种肝肿瘤的标志物[10,11]。PTX3与炎症反应及胰岛素抵抗有关，且参与肝脏疾病的发生、发展[12,13]。本研究中，发生S基因突变的慢性乙型肝炎肝硬化患者血清AFP、PTX3水平高于未发生S基因突变的患者。提示S基因突变可能与患者血清AFP、PTX3水平的升高有密切联系，推测HBV S基因发生突变后，使得蛋白质的生物学作用改变，病毒的复制能力及对肝脏的损伤能力增强，血清标志物AFP、PTX3表达水平上升。此外，本研究中S基因突变慢性乙型肝炎肝硬化患者血清中AFP、PTX3水平与肝功能指标AST、ALT、TBil均呈一定的相关性。进一步提示HBV S基因突变可引起患者肝脏损伤，造成其肝脏指标及血清标志物水平上升，密切监测各指标水平的变化，可能对临床改善患者预后有重要指导意义。

表1 肝炎组与肝硬化组一般资料、肝功能指标及S基因突变比较(±s)

表2 影响慢性乙型肝炎肝硬化患者预后的多因素logistic回归分析

综上所述，HBV S基因突变可能导致慢性乙型肝炎肝硬化患者血清AFP、PTX3水平升高，与预后有重要联系，但作用机制仍需深入探究，还需进一步探索S基因突变和血清AFP、PTX3在慢性乙型肝炎肝硬化预后中的实际应用价值。