肺腺癌患者不同标本二代测序基因突变检测结果及其临床特征分析

董礼 刘斌 江庆 齐保峰 范娟

组织癌变是由多个基因发生累积突变的一个多步骤过程，肿瘤细胞不同基因的位点改变、缺失、重复等，都会影响细胞生长和增殖的调控，从而促使肿瘤的发生[1]。每一种组织基因突变的亚型特性、最优治疗方式、预后等都各不相同；其中，以肺腺癌、含腺癌成分或具有腺癌分化倾向的其它非小细胞肺癌患者，携带敏感基因突变者最多，靶向治疗获益最大[2]。相关研究在NSCLC驱动基因中开展得最早，也最为成熟。临床上一般送检材料主要为组织标本(经手术切除、内镜下钳取或刷检、经皮针吸等)，以及非组织标本(胸腔积液、全血或血清等)，但二者的最终检测结果往往有一定程度的偏差。本文通过收集583例临床初诊确诊肺腺癌患者的二代基因测序法(next generation sequencing, NGS)检测结果及一般临床特征信息，回顾性分析对比不同标本来源下肺腺癌患者的EGFR、KRAS、ERBB2以及ALK等基因突变检出率情况。

资料与方法

一、研究资料

研究收集2018年5月至2020年12月在阜阳市人民医院/第二人民医院/肿瘤医院以及阜南/利辛/临泉县人民医院等6家医院就诊的583例初诊确诊肺腺癌患者。分析所有患者的临床资料，包括性别、年龄、TNM分期、吸烟史、标本来源，及通过经皮肺穿刺、支气管镜、手术切除等获得的肿瘤组织标本和血液、胸水等非组织标本下患者EGFR、KRAS、ERBB2以及ALK基因的二代测序突变检测结果。此研究已获得上述所涉医院伦理委员会批准。

二、方法

所有取材流程均由高年资医师亲自指导进行，保证样品标本的保存与运输、状态及样本质量均符合上机前标准。采用杭州瑞普基因的瑞吉安检测试剂盒、核酸提取试剂、测序反应通用试剂盒，以及Illumina HiSeq 4000测序平台进行测序。组织质控标准为：恶性肿瘤细胞占比≥20%、DNA总量≥10ng，平均测序深度为≥1000，不低于10%平均测序深度占比≥80%；液体标本测序质控：DNA总量≥10ng，平均测序深度≥8000，不低于10%平均测序深度占比≥80%。具体操作流程参见文献[3]。

三、统计学处理

采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析，组间率的比较采用Fisher确切概率法或χ2检验，计数资料采用例数或率(%) 表示；采用Logistic回归分析方法排除混杂因素影响后对不同标本亚组的基因突变检出进行二元分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、一般临床资料

通过χ2检验及Fisher确切概率法分析可见：583例肺腺癌患者中，EGFR基因突变在年龄≤65岁、不吸烟的女性患者中检出率相对较高(P<0.05)；KRAS基因突变在男性吸烟患者基因突变检出率相对较高(P<0.05)；ALK基因突变则在女性、不吸烟患者突变检出率相对较高(P<0.05)；而ERBB2基因突变在不同性别、年龄、吸烟史及肿瘤分期的检出率对比，差异无统计学意义(P>0.05)(详见表1)。

二、583例肺腺癌患者NGS检测EGFR、KRAS、ERBB2及ALK基因突变情况

583例肺癌患者中，EGFR基因突变普遍集中于外显子18～21位点，其中以19位点缺失及21位点L858R突变检出为主；KRAS基因突变主要集中于外显子2、3位点，以G12C突变为主；ERBB2基因突变则主要集中于外显子20位点； ALK基因突变22例，均检出为EML4-ALK 基因融合，其中含有p.G1202R点突变1例(4.55%)(见图1)。

三、不同标本来源下肺腺癌患者的EGFR、KRAS、ERBB2及ALK基因突变检出情况

排除一般资料等混杂因素可见：组织标本对于EGFR突变检出仍为最佳，其中具体组织取材方式之间并无统计学差异(P=0.492，>0.05)，但经内镜下、手术获取的组织标本却优于血液标本(P=0.033，P=0.020，<0.05)；KRAS、ALK基因突变检测亦是组织取材为先；而组织、血液、胸水等标本之间对于检出ERBB2基因突变均有统计学差异(P=0.024,<0.05)，其中经皮肺穿刺明显优于血液检出(P=0.033，<0.05)(见图2)。

表1 583例肺腺癌患者的一般临床资料及EGFR、KRAS、ERBB2及ALK基因突变检测情况[n(%)]

四、多基因共突变患者的临床特征

583例患者中共有13例多基因共突变者，检出率为2.23%，95%置信区间为(0.010,0.034)，除均含EGFR基因共突变外，分别为伴有5例KRAS基因突变、5例ERBB2基因突变/扩增、3例ALK基因融合。其中，女性8例，男性5例；年龄≥65岁者8例，<65岁者5例；TNM分期均为Ⅲ～Ⅳ期；有吸烟史12例；标本来源于组织者12例，来源于血液者1例。详细病理特征(见表2)。

表2 多基因共突变患者的临床特征

图1 583例肺腺癌患者NGS检测EGFR、KRAS、ERBB2及ALK基因突变情况

(注：图2-1、2-2、2-3、2-4分别为EGFR、KRAS、ALK及ERBB2各基因亚组对比；其中因经胸水未检出ERBB2基因突变，故未将胸水组列入亚组对比比较。)

讨 论

自2004年发现表皮生长因子受体(EGFR)基因突变起[4]，陆续又发现了许多其他突变，如ALK、BRAF、ROS1基因等[5]。这些致癌途径的发现，促进了靶向药物在抗肿瘤作用方面的发展，使得NSCLC的治疗取得了重大进步，患者生存结果显著改善[6]。指南建议：一旦确诊为非小细胞肺腺癌，均应尽快完善基因检测[7]；只有明确了患者的基因突变类型，才能精准指导患者的后续治疗，尤其是靶向药物、免疫药物的选用。

肺腺癌的生长特性主要沿管外及肺泡壁蔓延，常在肺周边部形成大小不等的肿块；早期也可侵犯血管、淋巴管。针对这一特性，我们一般可通过手术切除、内镜下钳取或肺穿刺等来获得其肿瘤组织；但临床工作中较多肺癌晚期患者因操作创伤大、身体耐受性差、肿瘤位置特殊等无法获得足够的组织样本。这时选择取材相对容易、侵入性小、重复性高的患者外周血、胸腔积液、肺泡灌洗液或脑脊液等液体标本来进行送检就显得十分重要[8]。肿瘤患者的血体液中含有因肿瘤细胞坏死、凋亡释放出的ctDNA，甚至CTC(circulating tumor cell，外周血液循环肿瘤细胞)，虽然二者含量相对少，但因包含了肿瘤细胞的基因组信息，可反映肿瘤进展现况，近些年来国内外学者争相通过各种渠道的超深度测序法来提高对ctDNA的敏感性和特异性，比如标记扩增深度测序(TAM-Seq)，肿瘤个体化分析深度测序法(CAPP-Seq)等；甚至检测出有组织标本中未检出的基因突变，但因受技术、经济等层面影响，目前仍未获得广泛应用。本文即通过回顾性收集安徽阜阳地区583例肺腺癌患者信息，结合基因NGS检测结果，分析其肿瘤的一般特征；从而进一步排除混杂因素，对比不同标本来源下的部分驱动基因二代测序检出情况。

本次研究中，共检测出：EGFR基因突变型为257例，突变率占比44.08%，这与Liu L P报道的46.7%[9]比较接近。作为目前研究相对充分的致癌途径之一，EGF诱导EGFR胞外区进行构象变化，进一步促进胞内区激酶活性的形成并进行自身磷酸化，进而招募下游信号分子完成细胞信号从膜外向膜内的转导作用。其激酶结构域突变主要发生在第18～21外显子处(其中，以19位点缺失及L858R位点突变者居多)；本研究中该基因突变主要涉及：19外显子124例(48.25%；其中位点缺失者117例，占45.53%)、21外显子122例(47.47%；其中L858R突变者114例，占44.36%)、20外显子26例(10.12%)、18外显子8例(3.11%)；这与2020年NCCN基因组统计的东亚患者EGFR突变占比基本相同[10]。国内外曾多次研究结果均显示血液与组织标本EGFR检测基因突变率一致性较高[11-13]，但在本次送检中的组织标本对比血液、胸水等非组织标本，可见经内镜下、手术获取标本明显优于血液标本(P=0.033，P=0.020，<0.05)。考虑血液中ctDNA含量极低，并且在机体容量的稀释作用下，导致EGFR检出的假阴性可能大，故建议临床上应多次送检外周血，以减少检验误差。

ERBB2基因突变型为24例(4.12%)，以酪氨酸激酶域的7～27外显子突变较多，本文中涉及该基因位点突变16例，其中：20外显子12例(50.00%)，7、11、17、27外显子均为1例(4.17%)；基因扩增10例(41.67%)。不同性别、年龄、吸烟史及肿瘤分期的基因突变率对比，差异无统计学意义(P>0.05)，而标本来源于组织、血液、胸水间均有统计学差异(P=0.024,<0.05)。检测率由高至低依次为组织(22例，6.06%)、血液(2例，1.36%)、胸水(0例，0.00%)。经胸水未检出该基因阳性突变，且整体检出率偏低，分析可能与胸水中细胞种类杂多，肿瘤细胞筛选效率低下、以及样本量较少及或分布不均有关，且NGS方法目前仍存在技术缺陷，故不建议作胸水送检的优先考虑。

KRAS基因作为EGFR的下游靶分子，检出突变38例(6.52%)，目前显示尚无适宜的靶向用药，但有研究分析，KRAS G12C或许是一个潜在的可用药靶点[14]。本研究显示男性吸烟患者该基因突变率相对较高(P<0.05)，不同标本来源之间无统计学差异(P=0.178，>0.05)；ALK基因突变为22例(3.77%)，且均含EMLK-ALK融合基因。自2007年该融合基因首次在NSCLC中被证实具有高度致瘤性以来，曾长期被认为与其他驱动基因突变存在互相排斥；但随着检测技术的不断发展，已经渐被推翻，本次研究中便涉及3例同时合并有EGFR基因突变的患者，且都为女性。全部检出突变中女性、不吸烟患者相对较高(P<0.05)，不同标本来源之间无统计学差异(P=0.423，>0.05)。这可能与地区及样本选择偏倚、检测手段的敏感性及个体差异、基因突变表达丰度等相关。

上述四种基因整体研究中：患者外周血检出率均较低于组织标本检出率，与胸水检出率接近；这可能与不同标本的检出灵敏度不一致相关。对于不同标本的基因检测最佳方式目前国内外仍存在较大争议[15]。以EGFR基因为例，目前应用最多的外周血检测方法是微滴数字聚合酶链反应法(droplet digital polymerase chainraction，ddPCR)和超级扩增阻滞突变系统(super-amplifi refractory mutation system，super-ARMS)，二者具有操作方便、费时少等优势，但特异性及灵敏度均有待提高[16]；NGS相比二者，虽可同时对上百万甚至数十亿个DNA进行分析，实现高通量测序的目标[17]，提高检验灵敏性；但其不足亦是对样本质量的要求性高，检测的成本大、周期长，程序复杂[18]。不同标本来源的最佳检测方法不一致，导致临床医生们的经验总结与判断显得尤为重要。

综上所述：各基因的突变情况与其部分临床特征之间存在相关性。不同标本来源的肺腺癌患者中部分基因突变检测率亦存在统计学差异，其中以组织标本检出率最高，具体取材途径之间并无明显差异；同时受当前检测手段及技术的不成熟等因素影响，NGS对血液标本的基因突变检出率次之，在临床上，面对承受度差、治疗意愿又相对积极的肺腺癌患者，我们可尝试多次送检外周血进行基因检测，以降低假阴性结果的可能，从而更精准指导患者的后续个体化诊治；另外胸腔积液因研究样本量有限，且检出率低，建议暂不优先选择NGS检测。