琥珀消石颗粒对肾脏草酸钙结石大鼠BMP2通路及炎症应激反应的影响

刘玉刚，张石军，刘龙，史马龙

榆林市第一医院泌尿外科，陕西 榆林 719000

肾结石是常见的泌尿系统疾病，外科治疗虽然能够有效清除结石，但却无法消除结石形成的病因，因此复发率较高[1]。草酸钙结石是最常见的肾结石类型，骨形成蛋白2(bone morphoenetic protein 2，BMP2)通路激活造成钙盐过度沉积、炎症反应及氧化应激反应激活造成肾草酸钙小管上皮细胞损伤与结石形成密切相关[2-4]。近年来，中医中药在肾结石治疗中的价值受到越来越多关注。琥珀消石颗粒由赤小豆、当归、琥珀、海金沙、金钱草、鸡内金、蒲黄、牛膝组成，是治疗泌尿系结石、胆结石的常用中成药。国内马治中的动物实验证实，琥珀消石颗粒对肾结石大鼠的肾脏病理改变及钙结晶沉积具有改善作用[5]，但与之相关的分子机制并不清楚。本研究将以BMP2通路及炎症应激反应为切入点，分析琥珀消石颗粒用于肾脏草酸钙结石大鼠治疗的价值。

1 材料与方法

1.1 实验动物 成年雄性SD大鼠10只、成年遗传性高钙尿结石雄性大鼠(SD遗传背景)20只均购自上海南方模式生物公司，生产许可SCXK(沪)2019-0002。

1.2 药物 琥珀消石颗粒(山东沃华医药公司，国药准字Z37020101)，15 g/袋、10袋/盒。

1.3 试剂与仪器 Von Kossa钙染色试剂盒(西安赫特生物公司，ST087)，骨形态发生蛋白2(BMP2)、Runt相关转录因子2(RUNX2)一抗(美国Abcam公司)，白介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)检测试剂盒(上海西唐公司)，丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)检测试剂盒(南京建成研究所)。

1.4 方法

1.4.1 动物分组及给药 成年雄性SD大鼠10只作为对照组，成年遗传性高钙尿结石雄性大鼠随机分为模型组和治疗组各10只，模型组给予10 mL/kg纯水灌胃，2 次/d；治疗组给予琥珀消石颗粒3.335 g·kg-1·d-1、每日分2 次灌胃，每次灌胃用10 mL/kg 纯水溶解。连续治疗4周。

1.4.2 尿液中草酸及钙含量的检测 末次灌胃后将大鼠放入代谢笼内，收集24 h 尿液，采用全自动尿液生化分析仪检测草酸含量及钙含量。

1.4.3 肾脏内钙沉积的检测 完成24 h 尿液样本收集后，腹腔注射1.0%戊巴比妥钠麻醉后解剖左侧肾脏，用4%多聚甲醛固定后制作病理切片，按照试剂盒说明书进行Von Kossa 钙染色，在显微镜下观察染色呈黑色的钙盐沉积情况。

1.4.4 肾脏中BMP2表达的检测 收集右侧肾脏组织，加入组织裂解液提取组织蛋白，将蛋白样本加入聚丙烯酰胺凝胶内进行Western blot 检测，电泳、电转膜、5%脱脂牛奶封闭后孵育BMP2、RUNX2、β-actin一抗过夜，次日孵育二抗，最后在凝胶成像系统中显影得到蛋白条带、计算条带吸光值，以β-actin 条带的吸光值为内参，计算BMP2、RUNX2的表达水平。

1.4.5 肾脏中炎症指标及氧化应激指标的检测 另取右侧肾脏组织适量，加入组织裂解液提取组织蛋白，按照试剂盒进行实验，检测IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA、SOD的含量。

1.5 统计学方法 采用SPSS21.0 软件录入数据并进行统计学处理，实验数据均为计量资料，以均数±标准差()表示，三组间比较采用方差分析，有统计学差异的资料进一步采用LSD-t 检验进行两两比较。检验水准为α=0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组大鼠肾脏内钙盐沉积比较 对照组大鼠肾间质内未见钙盐沉积，模型组大鼠肾间质内可见明显钙盐沉积，治疗组大鼠肾间质内钙盐沉积与模型组比较明显减少，见图1。

图1 三组大鼠肾脏内钙盐沉积的Von Kossa钙染色(×200)

2.2 三组大鼠24 h 尿草酸及钙含量比较 与对照组比较，模型组大鼠24 h尿草酸及钙含量均明显升高，与模型组比较，治疗组大鼠24 h 尿草酸及钙含量均明显降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 三组大鼠24 h尿草酸及钙含量比较()

表1 三组大鼠24 h尿草酸及钙含量比较()

注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05。

组别24 h尿钙含量(μmol)只数24 h尿草酸含量(mg)对照组模型组治疗组F值P值13.75±2.75 62.44±10.34a 29.37±5.12b 19.292 0.001 10 10 10 63.83±11.37 161.38±27.65a 94.17±15.57b 13.474 0.001

2.3 三组大鼠肾脏中BMP2、RUNX2 表达水平比较 与对照组比较，模型组大鼠肾脏中BMP2、RUNX2的表达水平均明显升高，与模型组比较，治疗组大鼠肾脏中BMP2、RUNX2 的表达水平明显降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表2和图2。

图2 三组大鼠肾脏中BMP2、RUNX2表达水平

表2 三组大鼠肾脏中的BMP2、RUNX2表达水平比较()

表2 三组大鼠肾脏中的BMP2、RUNX2表达水平比较()

注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05。

组别BMP2只数RUNX2对照组模型组治疗组F值P值0.68±0.09 0.98±0.10a 0.74±0.08b 5.686 0.006 10 10 10 0.65±0.08 1.09±0.15a 0.77±0.10b 6.123 0.002

2.4 三组大鼠肾脏中炎症反应指标比较 与对照组比较，模型组大鼠肾脏中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量均明显升高，与模型组比较，治疗组大鼠肾脏中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量明显降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表3。

表3 三组大鼠肾脏中的IL-1β、IL-6、TNF-α含量比较()

表3 三组大鼠肾脏中的IL-1β、IL-6、TNF-α含量比较()

注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05。

组别对照组模型组治疗组F值P值IL-6(pg/mL)152.67±29.24 371.45±65.37a 226.51±54.29b 12.383 0.001只数10 10 10 IL-1β(ng/mL)0.93±0.15 2.85±0.47a 1.42±0.26b 15.812 0.001 TNF-α(ng/mL)1.66±0.28 4.31±0.84a 2.93±0.55b 14.202 0.001

2.5 三组大鼠肾组织氧化应激指标比较 与对照组比较，模型组大鼠肾脏中MDA 的含量均明显升高、SOD的含量明显降低，与模型组比较，治疗组大鼠肾脏中MDA的含量明显降低、SOD的含量明显升高，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表4。

表4 三组大鼠肾脏MDA、SOD含量比较()

表4 三组大鼠肾脏MDA、SOD含量比较()

注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05。

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3 讨论

草酸钙结石是最常见的肾结石类型，临床治疗肾结石的主要方式是外科碎石和排石，效果确切，但因为无法消除结石形成的原因，所以排石治疗后的复发率高。肾结石的发病原因复杂，尿钙排泄增加、钙盐在肾脏内过度沉积是造成肾结石的直接原因，针对性减少尿钙排泄是治疗肾结石的潜在途径[6-7]。本研究以遗传性高钙尿结石大鼠作为肾结石模型大鼠，通过Von Kossa钙染色及24 h尿液检测证实：模型大鼠肾间质内钙盐明显沉积，24 h 尿钙含量及草酸含量均明显增加，表明钙盐沉积、尿钙排泄增多与肾结石的发病有关，与既往关于肾结石发病相关因素的研究一致。

中医中药是目前临床上治疗结石的常用方式，其中琥珀消石颗粒在肾结石、胆结石等疾病的治疗中展现出积极价值[8-9]。该颗粒方剂中的多种中药成分具有利小便、通淋、通经络、化瘀血的功效。肾结石属于中医“石淋”、“尿血”的范畴，发病与肾气亏虚以及下焦湿热有关，使用琥珀消石颗粒能够针对肾结石的中医病机发挥治疗作用[10-11]。本研究采用琥珀消石颗粒灌胃的方式对肾结石模型大鼠进行干预，干预后发现肾间质内钙盐明显减少，24 h 尿钙含量及草酸含量均明显降低，表明琥珀消石颗粒治疗肾结石大鼠能够减少钙盐沉积及尿钙排泄。

随着近些年分子生物学研究的进展，多项研究从分子层面阐明了肾结石发病的可能机制。BMP2是成骨分化过程中参与矿化调控的关键基因，该基因能够刺激钙沉积。白栩搏的动物实验证实，在特发性高钙尿大鼠肾结石形成过程中，肾脏内BMP2 及下游RUNX2的表达水平明显增加，提示BMP2通路参与肾结石的形成[2]。本研究对肾结石模型大鼠肾脏内BMP2 通路的分析结果与白栩搏的研究结果一致，即模型组大鼠肾脏内BMP2 及RUNX2 的表达水平高于对照组；加用琥珀消石颗粒治疗后，肾脏内BMP2 及RUNX2 的表达水平明显降低，表明琥珀消石颗粒治疗肾结石的作用与抑制BMP2通路有关。

在肾结石的发病过程中，钙盐沉积是始动因素和刺激因素，过度沉积的钙盐能够刺激炎症反应和氧化应激反应，大量生成的炎症因子及自由基会造成肾小管上皮细胞损伤，进而加重钙盐沉积、促进肾结石发病[12-14]。IL-1β、IL-6、TNF-α是重要的炎症因子[15]，MDA 是自由基与脂质发生氧化应激反应的产物，SOD 是促进自由基代谢的抗氧化酶[16]。本研究的分析结果显示：肾结石模型大鼠肾脏内IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA 的含量增加，SOD 的含量降低，与既往关于肾结石发病过程中炎症及氧化应激反应激活的认知一致；加用琥珀消石颗粒治疗后，肾脏内IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA的含量降低，SOD 含量增加，表明琥珀消石颗粒治疗肾结石的作用与抑制炎症反应和氧化应激反应有关。

综上所述，琥珀消石颗粒明显改善肾脏草酸钙结石大鼠的肾间质钙盐沉积，这一作用与抑制BMP2通路及炎症应激反应激活有关，未来琥珀消石颗粒有望成为防治肾结石的新药物，BMP2通路及炎症应激反应则有望成为研究肾结石发病机制及防治手段的新靶点。