miR-218-5p靶向B细胞淋巴瘤因子3表达影响白血病K562细胞的增殖和凋亡

高娟，邢海洲

白血病是一类常见的造血干细胞恶性克隆性疾病，主要表现为克隆性白血病细胞增殖失控、分化障碍、凋亡受阻进而导致其在骨髓和其他造血组织中大量累积，浸润其他非造血组织和器官，同时抑制正常造血功能。因此，如何有效的抑制白血病细胞的增殖促进其凋亡对白血病的治疗意义重大。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类具有18～22 个核苷酸的非编码小RNA，在白血病的诊断、预后和治疗中发挥着重要作用［1-2］。微小RNA-218-5p（miR-218-5p）是近年的研究热点miRNA，研究发现，miR-218-5p 在白血病病人中表达下调，过表达miR-218 通过靶向SNX4抑制白血病细胞增殖和侵袭，但miR-218-5p在白血病中的作用机制尚未完全阐明［3-4］。生物信息学分析显示，B细胞淋巴瘤因子3基因（B-cell CLL/lymphoma 3，BCL3）能够和miR-218-5p 相互作用，BCL3最初发现于B淋巴细胞白血病，研究发现BCL3在白血病病人体内表达显著上调［5］。但miR-218-5p能否靶向BCL3 参与对白血病细胞增殖和凋亡的调控尚未可知。因此，通过以下研究，以探讨miR-218-5p对白血病K562细胞增殖和凋亡的影响，初步探讨其作用机制，以期为白血病的治疗提供新的策略。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 主要材料和试剂 人慢性髓原白血病细胞K562购于中国科学院细胞库；RPMI-1640培养基、胎牛血清、青链霉素双抗、噻唑蓝（MTT）试剂盒购于美国Gibco 公司；LipofectamineTM2000 购于美国Invitrogen公司，总RNA提取试剂盒购于上海生工生物工程有限公司；模拟物阴性对照（miR-con）、miR-218-5p模拟物（miR-218-5p mimics）、干扰对照（si-con）、干扰BCL3（si-BCL3）、空载体（pcDNA）、过表达BCL3（pcDNA-BCL3）、抑制物对照（anti-miR-con）、抑制物miR-218-5p（anti-miR-218-5p）、BCL3 野生型荧光素酶载体（WT-BCL3）以及BCL3 突变型荧光素酶载体（MUT-BCL3）的构建由上海吉玛制药有限公司提供；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）细胞凋亡检测试剂盒购于南京凯基生物技术有限公司；B 细胞淋巴瘤因子3（BCL3）兔多克隆抗体、细胞增殖抗原（Ki67）兔多克隆抗体、细胞周期蛋白D1（CyclinD1）兔单克隆抗体、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Cleaved Caspase-3）兔多克隆抗体购于美国Abcam 公司；山羊抗兔Ⅱ抗购于广西锐博生物科技技术有限公司。

1.1.2 样本收集 白血病骨髓样本20例来源于2016年1月至2018年1月郑州大学第一附属医院的住院病人，所有病人均在其初诊时采集其骨髓标本。另取同时期10例正常骨髓捐献者骨髓标本为对照组。本研究在术前病人或其近亲属均签署知情同意书，本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 试验方法

1.2.1 细胞培养、转染和分组 将K562细胞接种于含有10%胎牛血清、1%青链霉素双抗的RPMI-1640培养基，于37 ℃、二氧化碳体积分数为5%的细胞培养箱进行细胞培养。按照1∶3比例传代培养，选取对数期细胞进行后续研究。按照每孔5×103个K562细胞接种于96孔板，按照LipofectamineTM2000 使用说明分别将miR-con、miR-218-5p mimics、si-con、si-BCL3转染至K562 细胞，依次标记为miR-con 组、miR-218-5p 组、si-con组、si-BCL3组，转染6 h更换培养液，转染48 h用胰蛋白酶消化收集细胞，进行后续实验分析。此外，正常培养的K562 细胞标记为NC 组（对照组）。为进一步验证miR-218-5p 是通过调控BCL3 表达影响白血病细胞的增殖和迁移，进行回复实验，将miR-218-5p mimics 分别与pcDNA 或pcDNA-BCL3共转染K562 细胞，分别标记为miR-218-5p+pcDNA组和miR-218-5p+pcDNA-BCL3 组检测K562 细胞的增殖和凋亡变化。

1.2.2 RT-qPCR 检测 取转染48 h 的各组K562 细胞，按照TRIzol 总RNA 提取试剂盒提取各组细胞的总RNA，检测总RNA 纯度后，采用一步法RT-PCR试剂盒将RNA 反转录为cDNA，最后将cDNA 进行实时荧光定量PCR，利用2-ΔΔCT法计算miR-218-5p 和BCL3 mRNA的相对表达水平。引物序列如下：miR-218-5p 正向引物 5’-TTGCGGATGGTTCCGTCAAGCA-3’，反向引物5’-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3’；U6 正向引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；BCL3 正向引物5’-GAAAACAACAGCCTTAGCATGGT-3’，反向引物5’-CTGCGGAGTACATTTGCG-3’；β-actin 正向引物5’-CCAACCGCGAGAAGATGA-3’，反向引物 5’-CCAGAGGCGTACAGGGATAG-3’。

1.2.3 MTT 法检测细胞增殖活力 转染48 h 时，各取一组K562 细胞，向每孔内加入终浓度为5 mg/mL的MTT 试剂20 μL，培养箱孵育4 h，向每孔内加入二甲基亚砜（DMSO）150 μL，培养箱继续孵育2 h 至结晶充分溶解，用酶标仪于波长490 nm 处测定各孔的吸光度值，计算细胞存活率。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡 转染48 h 后，胰蛋白酶消化细胞，用预冷的PBS 液洗涤细胞2 次，离心收集细胞。加入适量的1×结合缓冲液悬浮细胞，调整细胞浓度约为1×106个/毫升，取100 μL 细胞悬液加入流式管内，加入5 μL Annexin V-FITC，室温避光，轻轻地混匀10 min，再加入5 μL 的PI，室温避光孵育5 min，补加PBS 液至500 μL，混匀后，1 h 内用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.2.5 蛋白质印迹法（Western blotting）检测 转染48 h后，收集各组细胞，加入细胞裂解液于冰上裂解30 min，离心收集上清液即为细胞总蛋白。采用BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。取适量蛋白样品，煮沸5 min 使其充分变性，随后进行上样和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），利用湿法转膜装置将细胞蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。室温条件5%脱脂牛奶封闭1 h；Ⅰ抗溶液4 ℃孵育过夜；二抗室温条件孵育1 h；凝胶成像系统曝光后分析目的条带的灰度值。

1.2.6 双荧光素酶报告基因检测 采用生物信息学软件targetscan 进行靶基因预测显示，BCL3 的3’-UTR 含有与miR-218-5p 的互补配对的核苷酸序列，BCL3 是miR-218-5p 的潜在靶基因。利用LipofectamineTM2000 将BCL3 野生型荧光素酶报告基因载体WT-BCL3 和突变型荧光素酶报告基因载体MUT-BCL3 分别与miR-218-5p mimics 或miR-con 共转染K562 细胞，转染48 h 后，双荧光素酶报告基因检测试剂盒分析各组细胞的荧光素酶活性。

1.3 统计学方法采用SPSS 17.0 软件对计量资料进行统计学处理，两组间数据比较采用独立样本t检验进行分析，多组间间数据比较用单因素方差分析，进一步组间两两比较采用SNK-q检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-218-5p和BCL3白血病骨髓细胞和正常人骨髓细胞中的表达图1、表1、表2显示，与正常人骨髓细胞相比，白血病骨髓细胞中miR-218-5p的表达水平显著降低，BCL3 mRNA和BCL3蛋白的表达水平显著升高；与人正常骨髓基质细胞HS-5比较，K562细胞中miR-218-5p的表达水平显著降低，BCL3 mRNA和BCL3蛋白的表达水平显著升高（P＜0.001）。

图1 蛋白质印迹法检测白血病骨髓细胞和正常人骨髓细胞中BCL3表达

表1 检测白血病骨髓细胞和正常人骨髓细胞中miR-218-5p和BCL3表达/

表1 检测白血病骨髓细胞和正常人骨髓细胞中miR-218-5p和BCL3表达/

注：miR-218-5p 为微小-218-5p，BCL3 mRNA 为B 细胞淋巴瘤因子3 基因mRNA，BCL3 protein 为B 细胞淋巴瘤因子3 基因蛋白，Normal为正常人骨髓细胞，Cancer为白血病骨髓细胞。

表2 检测人正常骨髓基质细胞HS-5和白血病K562细胞中miR-218-5p和BCL3表达/

表2 检测人正常骨髓基质细胞HS-5和白血病K562细胞中miR-218-5p和BCL3表达/

注：miR-218-5p 为微小-218-5p，BCL3 mRNA 为B 细胞淋巴瘤因子3基因mRNA，BCL3 protein为B细胞淋巴瘤因子3基因蛋白，HS-5为人正常骨髓基质细胞，K562为白血病细胞。

2.2 miR-218-5p抑制白血病K562细胞增殖和诱导细胞凋亡图2、表3 显示，与NC 组和miR-con 组比较，miR-218-5p组白血病K562细胞miR-218-5p的表达水平显著升高（P＜0.001），表明过表达miR-218-5p的K562 细胞株构建成功。与NC 组和miR-con 组比较miR-218-5p 组白血病K562 细胞Cyclin D1 和Ki67蛋白的表达水平显著降低，Cleaved-Caspase-3的表达水平显著升高，细胞存活率显著降低，细胞凋亡率显著升高（P＜0.001）。提示，过表达miR-218-5p抑制白血病K562细胞增殖，诱导细胞凋亡。

图2 蛋白质印迹法检测白血病K562细胞Ki67、Cyclin D1、Cleaved Caspase-3表达（A）和流式细胞术检测白血病K562细胞凋亡（B）

表3 上调miR-218-5p表达对白血病K562细胞增殖和细胞凋亡的影响/

表3 上调miR-218-5p表达对白血病K562细胞增殖和细胞凋亡的影响/

注：NC 为对照组，miR-con 为模拟物阴性对照，miR-218-5p 为miR-218-5p 模拟物，Ki67 为细胞增殖抗原，CyclinD1 为细胞周期蛋白D1，Cleaved Caspase-3为活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶。①与miR-con组比较，P＜0.001。

2.3 miR-218-5p 靶向BCL3 调控其表达生物信息学软件targetscan 在线预测显示，miR-218-5p 和BCL3 的3’-UTR 存在部分连续的特异性结合位点，见图3。表4显示，与miR-con和WT-BCL3共转染组比较，miR-218-5p 和WT-BCL3 共转染组K562 细胞荧光素酶活性显著降低（P＜0.001）；与miR-con 和MUT-BCL3共转染组比较，miR-218-5p和MUT-BCL3共转染组K562 细胞荧光素酶活性变化无统计学意义。表5 显示，与miR-con 组比较，miR-218-5p 组K562 细胞BCL3 蛋白的表达水平显著降低；与antimiR-con 组比较，anti-miR-218-5p 组K562 细胞BCL3蛋白的表达水平显著升高（P＜0.001）。以上结果提示，BCL3 是miR-218-5p 的靶基因，miR-218-5p 可靶向负性调控BCL3表达。

表4 双荧光素酶报告实验/

表4 双荧光素酶报告实验/

注：WT-BCL3 为BCL3 野生型荧光素酶载体，MUT-BCL3 为BCL3突变型荧光素酶载体。

表5 miR-218-5p调控BCL3的表达/

表5 miR-218-5p调控BCL3的表达/

注：BCL3 为B 细胞淋巴瘤因子3，miR-con 为模拟物阴性对照，miR-218-5p 为miR-218-5p 模拟物，anti-miR-con 为抑制物对照，antimiR-218-5p为抑制物miR-218-5p。①与miR-con 组比较，P＜0.001。②与anti-miR-con 组比较，P＜0.001。

图3 miR-218-5p与BCL3互补的核苷酸序列（A）及miR-218-5p调控BCL3表达（B）

2.4 沉默BCL3 表达抑制白血病K562 增殖和诱导细胞凋亡图4、表6 显示，与NC 组和si-con 组比较，si-BCL 组K562 细胞BCL3 的表达水平显著降低，表明沉默BCL3 的K562 细胞株构建成功。与NC组和si-con组比较，si-BCL 组K562细胞Cyclin D1 和Ki67 蛋白的表达水平显著降低，Cleaved-Caspase-3 的表达水平显著升高，细胞存活率显著降低，细胞凋亡率显著升高（P＜0.001）。提示，沉默BCL3 抑制白血病K562 细胞增殖，诱导细胞凋亡。

表6 沉默BCL3表达对白血病K562细胞增殖和凋亡的影响/

表6 沉默BCL3表达对白血病K562细胞增殖和凋亡的影响/

注：NC 为对照组，si-con 为干扰对照，si-BCL3 为干扰BCL3，BCL3 为B 细胞淋巴瘤因子3，Ki67 为细胞增殖抗原，CyclinD1 为细胞周期蛋白D1，Cleaved Caspase-3为活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶。①与si-con组比较，P＜0.001。

图4 蛋白质印迹法检测沉默BCL-3表达对白血病K562细胞BCL3、Ki67、Cyclin D1和Cleaved Caspase-3表达的影响

2.5 过表达BCL3 部分逆转miR-218-5p 对白血病细胞K562 增殖和凋亡的影响图5、表7 显示，与miR-con组比较，miR-218-5p 组K562 细 胞BCL3、Ki67和Cyclin D1蛋白的表达水平显著降低，Cleaved Caspase-3 蛋白的表达水平显著升高，细胞存活率显著降低，细胞凋亡率显著升高；与miR-218-5p+pcDNA 组比较，miR-218-5p+pcDNA-BCL3 组K562 细胞BCL3、Ki67 和Cyclin D1 蛋白的表达水平显著升高，Cleaved Caspase-3蛋白的表达水平显著降低，细胞存活率显著升高，细胞凋亡率显著降低（P＜0.001）。提示，过表达BCL3能够部分逆转miR-218-5p对白血病细胞K562增殖和凋亡的影响。

表7 过表达BCL3表达部分逆转miR-218-5p对白血病K562细胞增殖和凋亡的影响/

表7 过表达BCL3表达部分逆转miR-218-5p对白血病K562细胞增殖和凋亡的影响/

注：miR-con 为模拟物阴性对照，miR-218-5p 为miR-218-5p 模拟物，miR-218-5p+pcDNA 为miR-218-5p 模拟物+空载体，miR-218-5p+pcDNA-BCL3 为miR-218-5p 模拟物+过表达BCL3，BCL3 为B 细胞淋巴瘤因子3，Ki67 为细胞增殖抗原，CyclinD1 为细胞周期蛋白D1，Cleaved Caspase-3为活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶。①与miR-con组比较，P＜0.001。②与miR-218-5p+pcDNA组比较，P＜0.001。

图5 蛋白质印迹法检测过表达BCL3 部分能逆转miR-218-5p对白血病K562细胞BCL3、Ki67、Cyclin D1和Cleaved Caspase-3表达的影响

3 讨论

白血病是一种常见的血液系统恶性肿瘤，近年来其发病率呈升高趋势［6］。骨髓移植作为白血病病人最有效的治疗手段，却存在供体难求、费用昂贵、并发症导致的死亡风险高等特点［7-8］。因此，探索新的白血病治疗策略势在必行。

近年来，大量的研究表明，miRNA在白血病的发生发展中发挥关键作用。miR-148b在急性髓系白血病病人及细胞系中的表达水平显著降低，过表达miR-148b 可引起细胞周期G0 至G1 期阻滞，细胞增殖受到抑制，细胞凋亡率增加［9］；miR-320c在白血病病人中显著低表达，miR-320c 表达水平升高是白血病病人预后良好的独立因素，过表达miR-320c 可通过调控磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信号通路抑制白血病细胞活性和克隆形成能力，诱导细胞凋亡，发挥抑癌基因作用［10］。近年来，miR-218-5p被报道在多种人类恶性肿瘤中具有抑癌基因作用。miR-218-5p 在胃癌组织中表达降低，miR-218-5p 低表达与胃癌晚期、淋巴结转移和预后不良有关，过表达miR-218-5p 在体内可抑制胃癌细胞的增殖，诱导细胞G1期停滞，抑制肿瘤生长和转移［11］；miR-218-5p 在前列腺癌中表达下调，过表达miR-218-5p 抑制前列腺癌裸鼠异种移植瘤的生长，抑制前列腺癌细胞的增殖和迁移，促进癌细胞凋亡，发挥抗肿瘤作用［12］。在白血病中，miR-218-5p 也是一种潜在的肿瘤抑制因子，但miR-218-5p 影响白血病进展的机制尚未完全阐明。为探讨miR-218-5p在白血病中的作用机制，本研究首先对白血病病人骨髓细胞和正常人骨髓细胞miR-218-5p的表达水平进行检测，结果显示miR-218-5p 在白血病病人骨髓细胞中表达下调，与相关研究结论相吻合［13］。选取K562细胞进行功能实验发现，过表达miR-218-5p 可显著抑制Cyclin D1和Ki67蛋白表达，促进Cleaved-Caspase-3 表达，抑制白血病K562 细胞增殖，诱导细胞凋亡。提示，上调miR-218-5p是白血病的潜在治疗靶点。

为进一步揭示miR-218-5p调控白血病细胞增殖和凋亡的分子机制，采用生物学信息软件进行预测靶基因，发现BCL3的3’-UTR存在miR-218-5p的部分结合位点。随后采用双荧光素酶报告基因证实BCL3是miR-218-5p的靶基因，Western blotting检测显示miR-218-5p可负性调控BCL3表达。BCL3是一种原癌基因，BCL3的表达失调与乳腺癌和非小细胞肺癌等实体肿瘤的进展有关［14-15］。BCL3在宫颈癌组织中表达上调，BCL3阳性表达与不良预后特征及生存率降低有关，下调BCL3抑制宫颈癌模型小鼠异种移植瘤的生长［16］；BCL3在卵巢癌中呈高表达，BCL3可促进程序性死亡配体1表达，增强卵巢癌细胞的存活、增殖和迁移能力［17］；此外，BCL3高表达与急性髓系白血病病人生存期短密切相关［5］此外，BCL3的表达水平与胶质瘤病人的总生存期显著相关，BCL3高表达预示肿瘤复发风险增加和预后较差［18］。本研究显示，BCL3在白血病病人骨髓细胞中表达上调，沉默BCL3可抑制白血病K562 细胞增殖，诱导细胞凋亡，与过表达miR-218-5p抑制BCL3的作用一致。进一步研究发现，过表达BCL3可逆转miR-218-5p对白血病K562细胞增殖和凋亡的影响。提示miR-218-5p在白血病中起抑癌基因作用，通过靶向下调BCL3表达来影响白血病细胞的增殖和凋亡。然而，miR-218-5p下游靶基因众多［19-20］，后续将对其他靶基因进行研究，全面揭示miR-218-5p对白血病细胞增殖和凋亡的调控作用。

综上所述，miR-218-5p 在白血病中表达下调，BCL3 表达上调，miR-218-5p 通过靶向调控BCL3 表达抑制白血病细胞增殖、促进细胞凋亡。本研究的发现为白血病的临床治疗指明了方向，miR-218-5p有望成为白血病的分子治疗靶点。