不同处理条件下婴幼儿配方奶粉中叶黄素含量的研究

王 芳，包怡红，陈 忱

1 北大荒完达山乳业股份有限公司质检中心，黑龙江哈尔滨 150078

2 东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨 150000

0 引言

叶黄素是一种脂溶性维生素，又叫“植物黄体素”，是人体所需的营养元素之一。在人体内，叶黄素大多数存在于眼睛的黄斑区和血浆中，是人眼中仅存在的两种胡萝卜素之一，能保护光成分，有效地预防视网膜损伤，防止视力退化，促进婴幼儿视力发育。除此之外，叶黄素还可以抗氧化、抗衰老，对于多种疾病有很好的预防作用，例如心脑血管疾病及肺癌等。故叶黄素是婴幼儿成长及人体预防疾病的重要营养素[1～4]。

母乳是婴幼儿最理想的营养食物。倡导宝宝出生后母乳喂养，可确保婴儿的健康成长发育。婴儿时期，其视力发育离不开叶黄素。叶黄素的摄入来源主要包括母乳或婴幼儿配方奶粉[5，6]。经过对母乳的研究发现，每100 g母乳中含有几十微克叶黄素，并且能够被婴幼儿100%吸收。但在没有母乳或母乳缺乏时，婴幼儿配方奶粉中的叶黄素则显得尤为重要。因此，叶黄素含量能否满足婴幼儿的需求成为对婴幼儿配方奶粉全面营养的要求[7～10]。

本文通过对比婴幼儿配方奶粉中叶黄素在不同处理条件下的含量情况，分析影响叶黄素含量的因素，为深入研究提高叶黄素提取率的方法提供方向。

1 材料与试验方法

1.1 仪器设备与标准品

1.1.1 仪器设备

液相色谱仪（紫外检测器），美国Perkin Elmer股份有限公司；紫外可见分光光度计，岛津（中国）有限公司；电子天平，梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司；旋涡振荡器，德国IKA集团；离心机，西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；氮吹仪，北京同泰联科技发展有限公司。

1.1.2 标准溶液

购买经国家认证并授予标准物质证书的叶黄素标准品（CAS号：127-40-2），叶黄素储备液：浓度c=50.000 0 μg/mL。标准工作液：从叶黄素标准贮备液中准确移取0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、1.00 mL标准溶液到25.00 mL棕色容量瓶中，0.1% 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）乙醇溶液定容后，从而得到浓度为0.100 μg/mL、0.200 0 μg/mL、0.400 0 μg/mL、0.800 0 μg/mL、2.000 0 μg/mL的系列标准工作液。

1.2 试剂

10.0%和20.0%氢氧化钾溶液。提取萃取溶剂：称取质量1.00 g BHT，环己烷200.00 mL溶解，与400.00 mL乙醚和400.00 mL正己烷，混合均匀。0.1%BHT乙醇溶液：称取0.10 g BHT，以100.00 mL乙醇溶解，混匀。

1.3 试验方法

随机选取超市一种品牌的婴儿配方奶粉（0～6月），较大婴儿配方奶粉（6～12月），幼儿配方奶粉（12～36月），通过改变前处理过程中室温避光处理条件、皂化时间、离心转速3 个条件，其他前处理条件不变，比较叶黄素含量变化。

1.4 样品前处理与测定

1.4.1 样品处理

准确称取质量2.00 g（精确至0.01g）均匀样品于50.00 mL离心管中，与0.20 g BHT和10.00 mL乙醇混合均匀，再加入10.00 mL10.0%氢氧化钾溶液，振荡混匀1.0 min，分别室温避光、低温避光、高温避光振荡皂化时间30.0 min、20.0 min、40.0 min，并与10.00 mL萃取溶剂避光振荡混合提取3.0 min，转速分别为4 500 r/min、2 500 r/min、5 500 r/min，离心3.0 min，提取重复2 次。合并提取液，以10.00 mL一级水洗涤，转速分别为4 500 r/min、2 500 r/min、5 500 r/min离心3.0 min至分层，重复洗涤1 次，合并有机相用旋转蒸发仪室温减压浓缩，以0.1% BHT 乙醇溶液振荡溶解残渣，定容至5.00 mL，过滤膜供上机液相色谱测定。

因叶黄素对光敏感，见光易分解，所有试验过程应在无500 nm以下紫外光的黄色光源或红色光源试验环境中进行。

1.4.2 色谱条件

色谱柱：C30色谱柱，5 μm，250 mm×4.6 mm（内径）或相当者；柱温：30 ℃；流动相：甲醇/水（88∶12，体积比，0.1% BHT）-甲基叔丁基醚（0.1% BHT），梯度洗脱时间，0.0～18.0 min，甲醇/水由100.0%变换为10.0%；18.1 min，甲醇/水由10.0%变换为100.0%，保留时间10.00 min；流动相流速：1.0 mL/min；检测波长值：445 nm；进样体积：10 μL。

1.4.3 标准工作液曲线制作

将标准工作溶液分别注入液相色谱仪中，测定上机所得峰面积，以标准工作溶液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制工作液曲线。

1.4.4 试样测定

标准工作液与待测样品溶液等体积进样，根据标准工作溶液色谱峰的保留时间和峰值面积，对试样色谱峰依据保留时间进行定性（待测定样品中色谱峰的保留时间与标准工作溶液相比变化范围值应在±2.5%之内），应用外标法定量。平行测定次数至少2 次。

1.5 分析结果的表述

试样中叶黄素含量按式（1）计算。

式中：X——试样中叶黄素的含量，单位为微克每百克（μg/100g）；c——由标准曲线而得的样液中标准品的含量，单位为微克每毫升（μg/mL）；V——样品最终定容体积，单位为毫升（mL）；m——称样量，单位为克（g）；F——校正系数。F可通过以下方式获得：用液相色谱分析试样溶液，将顺式与反式叶黄素色谱峰面积加合作为总峰面积，其中反式叶黄素峰面积除以总峰面积所得值为校正系数。

2 结果分析

2.1 标准曲线、检出限及定量重复性

根据国标《GB5009.248—2016 食品安全国家标准 食品中叶黄素的含量的测定》的测定要求，测量范围需要覆盖国标方法的最低浓度水平，即定量限（LOQ）和最低浓度水平，确定标准曲线浓度范围为0.333 7 μg/mL，0.667 4 μg/mL，1.334 9 μg/mL，2.002 3 μg/mL，2.669 8 μg/mL，3.337 2 μg/mL，所有溶度需用分光光度计校正，测定标准工作曲线（规定包含0点但不强制过0点），每浓度点需测3 次，3 次数据拟合得到线性参数，溶液浓度与对应峰面积见表1。

表1 叶黄素标准溶液浓度与对应峰面积

从试验结果可见，最终得出叶黄素的拟合标准曲线的线性方程为Y=0.7108X+0.018，R2=0.9990。标准工作曲线线性回归方程相关系数值大于0.99，曲线浓度范围覆盖关注浓度的0.0%～150.0%，满足《GB/T 27417—2017 合格评定化学分析方法确认和验证指南》的要求。

采取标准偏差法，选取阴性样品（即样品本身不含有叶黄素），称取10 份，每份称取2.0 g左右然后加入210 μL浓度为1.329 6 μg/mL的叶黄素标准溶液，按标准方法进行检测，检测限（LOD）的表示方法为3 s（表2），LOQ为3 倍的LOD。

表2 方法检出限与定量限结果分析表

图1 叶黄素标准溶液曲线

从试验结果可见，奶粉称样量为2.0 g，定容体积为5.00 mL时，方法检出限为1.08 μg/100 g，方法定量限为3.24 μg/100 g。称样量2.0 g，定容体积5.00 mL时，方法检出限为3.00 μg/100 g，方法定量限为10.00 μg/100 g，低于方法规定的检出限和定量限。

图2 叶黄素含量拟合结果图

2.2 前处理条件对叶黄素含量的影响

2.2.1 皂化时间对叶黄素含量的影响

由图3可知，皂化时间为30.0 min时，叶黄素含量为最高，1段、2段、3段含量分别为85.00 μg/100 g、190.00 μg/100 g、202.00 μg/100 g。说明皂化时间对叶黄素含量影响较大，皂化时间过短和过长都影响叶黄素含量，主要由于皂化时间可充分皂化提取更多的游离叶黄素。

图3 皂化时间对叶黄素含量的影响

2.2.2 皂化环境对叶黄素含量的影响

由图4可知，低温4 ℃和高温40 ℃都不利于叶黄素的提取，在室温25 ℃避光最有利于皂化环境，说明皂化环境改变不利于叶黄素的提取。注意试验全程应在避光条件下，防止叶黄素见光分解。

图4 皂化环境对叶黄素含量的影响

2.2.3 离心转速对叶黄素含量的影响

由图5可知当离心转速低于4 500 r/min时，离心效果不显著，叶黄素含量略低；当离心转速达到4 500 r/min以上时，叶黄素含量无显著变化，说明离心转速对叶黄素含量影响不大。

图5 离心转速对叶黄素含量的影响

3 讨论

本试验通过改变前处理皂化时间、皂化环境和离心转速条件改变，研究叶黄素含量的变化。结果表明，皂化时间和环境变化对叶黄素含量影响最大，皂化时间过短和过长都影响叶黄素含量；低温4 ℃和高温40 ℃都不利于叶黄素的提取，离心转速对叶黄素含量影响较小。

叶黄素的功能主要为抗氧化和缓解视疲劳，是婴幼儿不可缺少的主要营养元素之一。为了更好的满足婴幼儿视力发育所需，婴幼儿配方奶粉中叶黄素的添加必不可少，并尽可能使婴幼儿配方奶粉与母乳养分成分的吸收率更为接近。叶黄素提取率在近几年仍将是备受瞩目的研究领域及方向[10～15]。