水牛乳乳饼发酵菌种筛选及工艺优化

但 霞，曾庆坤＊，谢耀峰

1 中国农业科学院广西水牛研究所，广西南宁 530001

2 广西水牛乳工程技术研究中心，广西南宁 530001

0 引言

乳饼（Dairy Cake）是路南撒尼族地区的一种传统乳制品，以香醇的风味和良好的可烹饪性而广受欢迎。乳饼是一种典型的加热酸凝鲜干酪，目前乳饼大多采用传统作坊式生产，加工工艺没有标准化；乳饼生产用的酸水，多为凭经验自然生成，因此，存在微生物组成复杂，可能导致污染和产品质量不稳定等问题。而酸水质量直接影响到乳饼的产量、色泽、风味以及成型，没有标准化的酸水使乳饼生产很难走向工业化、规模化[1～5]。因此，筛选发酵菌株建立标准化的生产工艺流程是乳饼产业化的发展方向。

广西奶水牛存栏量4.42 万头，是我国水牛存栏第一的省份，水牛奶资源丰富，产量2.76 万吨，位居全国首位[6]，但水牛奶深加工技术较为缺乏，产品形式及种类较为单一。因此，发展新型水牛乳加工技术，丰富水牛乳产品种类，对我区水牛产业发展壮大具有重要意义。

本研究利用云南乳饼的加工工艺，筛选优良的乳清发酵菌株，并通过正交试验优化水牛乳乳饼的生产工艺，为乳清巴氏杀菌后接种鼠李糖乳杆菌RSF1，37 ℃发酵至乳清pH3.6停止；原料乳标准化，预热至90 ℃，随后降温至70 ℃，分两次添加发酵乳清，保温凝乳4 min，过滤入模压制2 h后放入4 ℃冷藏，所制得乳饼得率最高可得32.500%，质地细腻，奶香浓郁，可烹饪性强。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

生水牛乳：广西水牛研究所种蓄场。

试验菌株：水牛乳乳清自然发酵分得乳酸菌18 株。

试验试剂：MRS肉汤培养基，MRS琼脂培养基，广州环凯微生物科技有限公司；游离脂肪酸检测试剂盒，南京建成生物工程研究所；石油醚，乙醚，无水乙醇，盐酸，三氯乙酸，邻苯二甲醛等试剂，分析纯，天津博迪化工股份有限公司。

试验设备：FOSS120乳成分检测仪，FOSS8400蛋白检测分析仪，丹麦 福斯集团公司，TMS-Pro质构仪，美国FTC公司，ME204E分析天平，梅特勒-托利多中国公司，Galaxy 170s恒温培养箱，德国艾本德公司，UV-800紫外分光光度计，上海元析仪器有限公司，Thermo D-37520冷冻离心机，美国赛默飞科技公司。

1.2 试验方法

1.2.1 发酵菌株筛选

将乳酸菌活化，用MRS肉汤37 ℃培养24 h，至生长对数期，传代3 次，离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤，按体积5.000%（v/v）接种巴氏灭菌乳清，37 ℃发酵48 h，检测发酵液pH值、游离脂肪酸浓度和蛋白水解度，游离脂肪酸采用试剂盒方法检测。

蛋白水解度（DH）检测方法：称取2 g乳饼样品与10 mL三氯乙酸溶液（75.000%）混合，3 000 r/min，4 ℃离心15 min，取上清液用0.45 μm滤膜过滤，取30 μL滤液与1 mL邻苯二甲醛混合，在室温下保存2 min，用紫外分光光度计测340 nm波长下的吸光度，DH表示游离NH3基团在340 nm处的测量吸光度。

1.2.2 乳饼工艺单因素试验

乳饼样品的制备：新鲜牛奶，加热75 ℃以上，添加发酵酸乳清（占牛奶15.000%～25.000%），搅拌，保温凝乳（75～80 ℃，5 min），形成凝乳颗粒，过滤，压制成型。

（1）原料奶不同蛋白脂肪比

分别调配蛋白脂肪百分比为0.55:1、0.6:1、0.65:1、0.7:1 的4 个比例的鲜水牛乳，用相同的乳饼工艺制作乳饼，测各比例得率。

（2）不同凝乳温度

分别以65 ℃、70 ℃、75 ℃、80 ℃、85 ℃、90 ℃作为乳饼凝乳温度，测定不同温度对乳饼得率及质构的影响。

（3）不同乳清添加次数

取用相同量的乳清，设置1 次、2 次、3 次乳清添加，每次添加后搅拌均匀并保温凝乳2 min，观察不同乳清添加次数对乳饼得率的影响。

（4）不同预热温度

对比不同预热温度对乳饼得率的影响。

（5）不同乳清pH值

设置3 个梯度pH值3.30、3.60、3.90，观察不同乳清pH值对乳饼得率，乳清添加量等因素的影响。

（6）不同加水量

设置原料乳不加水、10.000%、20.000%（w/w）3 个梯度加水情况，观察乳饼得率。

1.2.3 乳饼工艺正交试验

设置凝乳温度，预热情况，乳清pH值，乳清添加次数，4因素3水平正交试验，具体试验参数如表1所示。

表1 正交试验因素及水平设计

1.2.4 乳饼理化指标

水分质量分数根据《GB 5009.3—2010 食品安全国家标准 食品中水分的测定》中常压干燥法测定。蛋白质根据《GB/T 5009.5—2010 食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》采用微量凯氏定氮法（N×6.38）测定。脂肪根据《GB 5009.6—2016 食品安全国家标准食品中脂肪的测定》测定。乳饼得率= 鲜乳饼质量/原料奶质×100%。

乳饼质构测定：TPA质构仪，感应元件50.0 N，形变量25.000%，下降速度60 mm/s，最小作用力0.1 N，每个样品取样3 次，测3 次，取平均值。

1.2.5 数据处理

试验数据采用SPSS 20处理，Origin 2018 作图，正交计算采用Minitable 17.0设计并计算。

2 结果与分析

2.1 乳清发酵菌株筛选

菌株发酵乳清结果如表2所示。乳饼制作过程主要靠酸化的乳清在高温条件下絮凝牛乳中的蛋白，因此，菌株的产酸能力需要较强，从表2可以看出菌株RSF1、PY7、D3发酵液pH值较低，相同发酵条件下，3 个菌株产酸能力更强，比较符合要求。游离脂肪酸和水解蛋白浓度则可以表明菌株水解蛋白和脂肪的能力，而脂肪酸和氨基酸是风味的主要来源[7～9]，因此，选择分解脂肪蛋白能力强的菌株可以为发酵乳清带来更多风味，更有利于乳饼风味的形成。从游离脂肪酸和蛋白水解度数据来看，菌株PY7均低于RSF1，菌株D3蛋白水解度略高于RSF1，但游离脂肪酸浓度明显低于RSF1，综合数据来看，菌株RSF1产酸快，且分解蛋白脂肪能力较强，符合试验目的，所以选择该菌株作为乳清发酵菌株。

表2 不同菌株乳清发酵液检测结果

2.2 乳饼制作单因素试验

如图1A所示，经过不同蛋白脂肪比制作乳饼可知，相同加工条件下原料乳蛋白∶脂肪=0.65时乳饼得率最高，0.70比例次之，0.55最低。这说明蛋白越少，乳饼的得率越少，因此，在标准化的过程中，将蛋白脂肪的百分含量比调整为0.65更有利于生产。

从不同的凝乳温度试验（图1B）可以看出，凝乳温度随着从65 ℃到90 ℃越来越高，凝乳时所需的乳清越来越少；65 ℃时保温凝乳，所需要酸乳清的质量占原料乳的40.000%左右，70 ℃时即下降至24.000%，至90 ℃凝乳时，只需约14.500%，这是牛奶在加热过程中形成磷酸钙释放H+而降低pH值，温度越高酸度降低越明显[10～12]。乳饼得率则在70 ℃时达到最高，75～90 ℃则随温度的升高迅速降低至22.000%左右，Fox等研究发现，70～75 ℃时乳清蛋白中的β-Lg蛋白结构展开，更容易与酪蛋白结合，且αs-CN和β-CN的解聚量在70 ℃左右达到最高；当加热温度高于70 ℃，蛋白解聚量与加热温度呈负相关[13，14]，与试验中70～75 ℃样品得率较高的结论相吻合。而陶亮等[2]的试验中乳饼最高得率凝乳温度为80 ℃，这可能是水牛乳原料、工艺等多方面的差异因素造成。从咀嚼力看，凝乳温度越高，咀嚼力越大，凝乳温度越高，蛋白絮凝结构越致密，硬度越高；而乳饼硬度较高时磨牙感强烈，食用感不佳，相对而言咀嚼力小的样品口感更好。

图1 乳饼单因素试验对乳饼得率的影响

原料乳预热后得率增加（图1C），这说明延长高温蒸煮时间更有利于此种条件下奶中更多蛋白的酸凝，酪蛋白是热稳定性蛋白，而乳清蛋白为热敏感性蛋白，易热变性，变性的乳清蛋白发生分子内和分子间的相互作用形成凝聚物，加热导致变性乳清蛋白与酪蛋白胶束表面蛋白结合，改变其胶束表面毛发状结构，使胶束内部疏水性基团和Ca2+敏感蛋白暴露出来，进而发生强烈凝聚趋势，且跟容易与Ca2+发生络合[15]，所以在酸作用前，预热加速了乳清蛋白的变性，使其更容易析出，但这是否是乳饼得率增加的原因，还需要进一步验证。

从图1D可以看出，随乳清pH值的增加，乳饼得率相应增加，研究发现乳清蛋白中热稳定性随pH值增加而降低[16]，因此，在高pH值中乳清蛋白更容易变性析出。试验中pH值3.30的乳清得率明显低于pH值3.60和3.90样品，但pH值3.90的乳清需要添加的量较多，不利于节能生产。传统工艺中，原料乳直接在锅中加热，当原料乳固形物含量过高时容易出现糊锅现象，所以在加热水牛奶或羊奶时往往会加水稀释，李昌盛等[17]还对加水量进行了对比发现将原料乳稀释2 倍最佳。本试验采用隔水加热的模式，杜绝了糊锅的现象，且经过试验发现（图1E）不加水生产乳饼得率反而高，且加水后原料体积增加，对生产能源及饮用水都造成了不必要的浪费。

不同的乳清添加次数所需要的乳清量也不同，图1F试验中1 次添加凝乳所需要的乳清最多，而2 次和3 次则相差不明显，但3 次添加的乳饼得率较高。

2.3 乳饼工艺正交试验结果

根据表3数据可知，2号处理的得率最高，可达32.500%，高于文献记载得率[2]，对乳饼得率影响的主次顺序为：乳清的pH>原料乳预热>凝乳温度>乳清添加次数，其最优工艺为A1B2C2D2；因此在发酵乳清时要严格控制乳清pH值。原料乳预热情况对乳饼得率影响也较为显著，对比9 个样品的预热情况来看，在70 ℃凝乳时（样品1~3）未预热样品得率只有25.5%，而预热后样品均在30%以上；高温凝乳样品（样品4~9）预热对得率的影响大大降低，但得率均高于1号未预热70 ℃凝乳样品，说明加热对增加乳饼得率有较大的作用，虽然文献中表面高温会使乳清蛋白变性析出[10，15]，但针对本研究的乳饼还需要进一步对蛋白成分检测进行验证。凝乳温度对乳饼得率的影响较弱，说明试验设置的温度梯度范围过小，但前期试验表面，温度过低会导致乳清的添加量大大增加，且未预热的原料乳在低于70 ℃时凝乳对乳饼后续的可烹饪性有较大影响，因此，综合各个因素选择70~90 ℃的温度区间。

从乳饼咀嚼力的计算结果来看（表3），对乳饼咀嚼力影响的主次顺序为：凝乳温度>乳清的pH>乳清添加次数>原料乳预热，最优工艺为A1B3C1D2；乳清pH值在3.6和3.8试验样品结果不显著，但高pH值会加大生产过程中使用的乳清量，从而造成能源及水的浪费；而较低的pH值则会延长乳清的发酵时间，占用发酵罐及消耗能量，或者需要加大接种量，因此需要对比具体的能源消耗以确定最优pH值。

表3 乳饼正交试验结果

根据表4数据可知乳饼蛋白脂肪含量、咀嚼力、硬度均与得率呈负相关，水分含量与得率呈正相关，即水分含量越大，蛋白脂肪含量越低，乳饼咀嚼力和硬度越低；弹力3，4号处理较高，而7，8，9号样品较低，说明凝乳温度高，乳饼弹力有所减弱，但总体样品间弹力差异不明显；黏性则随凝乳温度的升高而升高，70℃时黏性1.24~1.87，90℃时升高至3.64，说明温度越高，乳饼结构越致密。

表4 乳饼样品理化及质构检测结果

2.4 验证试验

根据正交试验结果，选取两种最优工艺进行放大验证，结果如表5所示，A1B2C2D2工艺所制得样品（1，2号）得率均在30%以上，明显高于A1B3C1D2工艺样品（3，4号），且在生产中，得率高的产品咀嚼力也相对较低，口感较佳，因此主要的判别指标为产品得率，故乳饼最优工艺为A1B2C2D2。

表5 验证试验

3 结论

经过一系列试验表明，影响乳饼得率和咀嚼力的主要因素是乳清pH值及凝乳温度。温度越高，乳饼咀嚼力越大，因此，低温凝乳所制乳饼口感更佳；乳清pH值越低则乳饼得率越低，但过高的pH值则会导致乳清添加量大大增加，会增加生产用水和耗能。通过正交试验表明，乳饼的较大得率，低咀嚼力生产工艺为：原料乳提前预热至90 ℃，随后降温至70 ℃，分两次添加乳清并保温凝乳，随后过滤，在模具中压制成型，其得率可达32.500%。