夹脊电针对急性脊髓损伤大鼠炎症因子表达的影响

李晓宁,田秀燕,唐祎周△

(1.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001；2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

脊髓损伤(SCI)是由外部伤害导致的中枢神经系统损伤疾病，目前全世界有超过200万人患有SCI后遗症，诸如运动、感觉障碍及神经源性膀胱和胃肠道功能障碍等[1-3]。脊髓继发性损伤是最具破坏性的一种，表现出神经炎症、电解质紊乱和兴奋性氨基酸中毒等复杂的病理反应，而炎症反应的持续性特征是导致患者处于长期的神经功能障碍状态的关键因素，如何有效减少炎症损伤是治疗SCI的重点。NLRP3炎症小体是当前炎症反应的研究热点，作为一类多聚体蛋白复合物，在SCI炎症反应过程中可引发炎性细胞因子的释放[4-5]。因此，抑制NLRP3炎症体的活化对减轻脊髓损伤炎症损伤、改善神经功能至关重要[6]。本实验研究采用Allen’s打击法制备脊髓损伤模型，观察夹脊电针是否可以抑制NLRP3、IL-1β和IL-18等脊髓损伤相关炎性因子的表达，为SCI患者的康复治疗提供重要的实验数据支撑和治疗方向指导。

1 材料和方法

1.1 实验动物与分组

本实验中使用的大鼠为SPF级雌性SD大鼠，由辽宁长生生物技术有限公司供应，数量为72只，平均体质量为(220±10)g。大鼠所处实验室照明环境为每天12 h的照明时长，实验室室温(23±2)℃，湿度40%～50%。采用随机法将大鼠按照类别分为假手术组(Sham组)、模型组(Model组)和夹脊电针组(EA组)，再根据1 d、3 d、7 d和21 d的治疗时间分为4个亚组，每组各6只。

1.2 主要试剂和仪器

多聚甲醛(沈阳西陇化工有限公司，批号190823)；水合氯醛(阿拉丁，批号C101202)；生理盐水(哈尔滨三联药业，批号 200814D08)；注射用青霉素钾(江西金康佳生化药业有限公司，批号200802)；显微镜(BX53, OLUMPUS，日本)；显微镜拍照系统(DP73，OLUMPUS,日本)；超速冷冻离心机(H-2050R，长沙，China)；电泳仪(DYY-7C，北京)；电针治疗仪(常州英迪电子医疗器械有限公司，KWD-808-Ⅱ型)；石蜡切片机(RM2235，Leica，German)；电热恒温培养箱(DH36001B，天津泰斯特，天津)；针灸针(0.35 mm×13 mm华佗牌，中国)；镜拍照系统(OLUMPUS，DP73，日本)；NLRP3(A10511，ABclonal，中国)；全蛋白提取试剂盒(WLA019，wanleibio，中国)；苏木素-伊红试剂盒(WLA051a，wanleibio，中国)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(WLA004，wanleibio，中国)；SDS-PAGE电泳液干粉(WLA026，wanleibio，中国)；PVDF膜(IPVH00010，Millipore，美国)；ECL发光液(WLA003，wanleibio，中国)。

1.3 造模方法

使用改良Allen’s打击法造模。首先对大鼠进行麻醉，使用麻醉剂为10%水合氯醛溶液，麻醉注射方式为腹腔注射麻醉(麻醉剂中水合氯醛溶液浓度为3.5 mL/Kg)，对麻醉后的实验大鼠进行俯卧位捆绑固定。以大鼠的T10脊髓节段为中心，去除脊柱附近的皮毛，消毒后用手术刀沿脊柱正中线，在T10上、下各作约1.5 cm长的切口，分离皮下筋膜及肌肉组织，清晰暴露T9～T11棘突，剪掉棘突和椎板，完全暴露脊髓组织，将5 g的砝码消毒后置于玻璃管中，垂直固定于脊髓正上方10 cm，然后垂直落下造成脊髓撞击伤，此时可立即观察到被撞击的部分迅速充血颜色变深至深红或红紫色，同时大鼠尾部出现一过性的不自主抽搐，然后止血并且缝合伤口。大鼠醒后评估其肢体功能，将BBB评分结果在1～3分的纳入实验。

假手术组：仅暴露T9～T11椎板下的脊髓，压迫止血，随后不做其他处理，缝合肌肉组织和皮肤。

术后护理：大鼠完成夹脊电针治疗后，立刻腹腔注射生理盐水5 mL，每日对实验大鼠进行青霉素肌肉注射，注射频率为2次/d，共注射3 d。

1.4 干预方法

1.4.1 电针组 大鼠电针穴位定为T9和T11两处穴位，实验所使针灸针尺寸为0.35 mm×13 mm，直刺腧穴下，深度4～5 mm，感觉针尖触碰到椎板，然后同侧夹脊穴接在同一组电针仪上，上接正极，下接负极，频率定为100 Hz，电流为大鼠背部肌肉微弱抽动，并且没有剧烈挣扎即可，每天治疗1次，每次30 min。

1.4.2 假手术组和模型组 仅采用相同方法捆绑，不予任何处置，每日30 min。

1.5 标本采集

各组大鼠在1 d、3 d、7 d及21 d分别处置结束后，用10%水合氯醛溶液进行腹腔注射麻醉，大鼠被完全麻醉后，用多聚甲醛灌注进行固定，随后采用冰盒对脊髓组织进行低温采样，脊髓组织样品长度约4 cm，于4 ℃冰箱存放备用。

1.6 检测指标

实验中大鼠脊髓组织HE染色观察：将脊髓置于多聚甲醛固定液中固定12 h后，分别进行后固定、梯度酒精脱水和石蜡包埋后行连续横向切片等步骤，最后进行HE染色，将染色后样品进行树脂封片，使用电子显微镜进行染色效果的观察分析，拍照倍数200×。 免疫组化检测各组大鼠脊髓组织中NLRP3、IL-1β和IL-18阳性细胞的表达情况。Western-blot测定脊髓组织中NLRP3蛋白表达。

1.7 统计学处理

采用SPSS20.0对数据进行分析处理，相关计量资料均用均数±标准差表示，采用ONE-WAY进行方差分析，方差齐采用LSD法，方差不齐分析采用Dunnett’s T3法，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠脊髓组织病理学观察

从图1可知，Sham组脊髓组织切片结构形态完整，灰白质分界明显，且神经元无胞体肿胀，光镜下范围内未观察到明显出血区域。

Model组大鼠在术后1 d后的HE染色结果显示，损伤脊髓组织区域结构破坏显著，组织结构疏松，灰白质无明显界限，可见炎症细胞浸润。此外，图中还可发现Model组大鼠病态造血面积及胞浆空泡变性明显多于EA组。

术后3 d Model组脊髓出血灶面积较1 d时降低，炎性细胞浸润增多，灰白质间隙不明显，明显的神经元胞体肿胀，Model组胞浆空泡变性及炎性细胞浸润明显多于EA组。

术后7 d病态造血面积基本消失，炎性浸润加重，细胞核花瓣样核、多核、核畸形和核碎裂现象明显加重，Model组胞浆空泡变性明显多于EA组。

术后21 d灰白质界限不可见，炎症细胞浸润较7 d时稍有减少，红系前体细胞成熟障碍较7 d减少，病态造血面积基本消失，Model组胞浆空泡变性依旧明显多于EA组，EA组脊髓组织内正常神经元较Model组数量增多。

图1 各组大鼠脊髓组织HE染色结果(200×)

2.2 各组大鼠脊髓组织中IL-1β、IL-18和NLRP3阳性细胞的表达

大鼠脊髓组织IL-1β表达结果：经检测，与Sham组相比，各时间点Model组的IL-1β表达均升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与Model组相比，在3 d、7 d和21 d时EA组脊髓组织的IL-1β表达均降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠IL-1β的平均光密度值比较

大鼠脊髓组织中IL-18表达结果：与Sham组相比，Model组在各时间点的IL-18表达升高，差异有统计学意义(P<0.05)；经过电针治疗后，与Model组相比EA组脊髓组织在3 d、7 d和21 d的IL-18表达均下降，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠IL-18的平均光密度值

各组大鼠脊髓组织中NLRP3的表达：Sham组中NLRP3含量极低，与Sham组比较，Model组大鼠脊髓组织NLRP3蛋白表达在1 d、3 d、7 d、21 d各个时间点显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与Model组相比，EA组大鼠脊髓组织NLRP3表达水平在术后3 d、7 d、21 d均下降，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠NLRP3的平均光密度值比较

2.3 各组大鼠脊髓组织NLRP3蛋白表达水平

Sham组中NLRP3的含量极低，与Sham组比较，Model组和EA组大鼠脊髓组织NLRP3蛋白表达在1 d、3 d、7 d、21 d各个时间点显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与Model组相比，EA组在3 d、7 d、21 d均明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4和图2。

表4 各组大鼠脊髓组织中NLRP3的蛋白表达

图2 各组大鼠脊髓组织NLRP3蛋白表达(n=6)

3 讨论

从中医的角度出发，脊髓损伤这一病症归属于“痿证”范畴，《黄帝内经·灵枢》曰：“身有所伤，血出多……所有所堕坠，四肢懈惰不收，名为体惰。”，《儒门事亲》云：“四末之疾……弱而不用为痿”，这些与现代脊髓损伤后出现的肢体运动功能障碍临床表现相符。中医研究认为该疾病的主要产生原因为人体经脉中的督脉受损，经脉循行不通，气血闭阻，人体肌肉和筋脉得不到充盛和濡养，患者表现为痿废无力。在人体经脉分布中，夹脊穴与督脉和膀胱经背俞穴相邻，对夹脊穴的针灸刺激可振奋机体阳气，使患者全身气血加速流通。研究结果表明，电针治疗可发挥针刺作用和电刺激作用，电针刺激夹脊穴可以明显改善急性脊髓损伤患者的神经功能[7-9]。现代医学认为对夹脊穴进行电刺激能有效改善局部缺血缺氧情况，抑制炎症反应等改善神经微环境[10-11]。夹脊穴下分布有脊神经，因此夹脊电针通过对神经体液的调节可对人体运动和感觉功能进行调整。目前，研究团队经过实验研究和分析表明[12-13]，夹脊电针治疗的干预能有效降低SCI后Cleaved caspase-1和IL-1β等多个因子的表达，进而抑制组织炎症反应过程，以达到促进损伤神经功能恢复的目的。

SCI通常由机械外力引起，随后发生的继发性损伤包括炎症、缺血缺氧及脱髓鞘等形成复杂的微环境破坏原有的平衡，在此过程中，神经元和其他神经细胞受损后会分泌大量炎症因子，起到活化小胶质细胞和巨噬细胞浸润的作用，形成局部炎症微环境[14]。现有研究结果表明脊髓损伤后的发生后短时间内，神经炎症是重要因素，在SCI初期，神经炎症有助于限制组织损伤，但是当细胞损伤程度进一步发展时，神经炎症过度则会导致神经细胞的凋亡和坏死[15-16]。

NLRP3炎症体是近年来发现的引起炎症反应、加重局部损伤的重要炎症因子，NLRP3在SCI继发性损伤过程中起着重要作用。越来越多的治疗SCI相关研究证明，抑制NLRP3炎症小体活化，可以调节神经炎症，改善由SCI引起的功能障碍[17-19]。Li Na等[14]研究证明SCI大鼠的NLRP3表达在联合治疗后显著下调，同时Caspase-1的激活受到抑制，导致IL-1β、IL-18的前体表达水平降低，从而达到有效减轻炎症反应目的。抑制NLRP3中炎症因子的激活以及相关炎症蛋白的分泌，能抑制脊髓损伤后炎症的发生和发展[20]。因此，抑制炎症、促进神经恢复是治疗SCI有效途径。本实验通过观察夹脊电针对大鼠SCI的影响，发现夹脊电针可以明显改善大鼠肢体运动功能，电针后脊髓组织的病理形态学充血和结构损伤有所缓解，脊髓炎症损伤程度具有明显好转趋势。

综上所述，脊髓损伤后对相应夹脊穴位行电针治疗，能够有效抑制NLRP3、IL-18和IL-1β的表达，从而减少炎症反应，改善微环境，缓解脊髓损伤。现有治疗脊髓损伤的药物和方法十分有限，NLRP3炎症体是目前治疗脊髓损伤、探讨机制的靶点和热点，夹脊电针对NLRP3炎症体的激活及其他细胞因子和途径，可以从不同的激活方式进一步深入研究。