19种加工辣椒辣椒素提取、纯化及其含量测定

霍瑞春，王国泽，姚慧静，袁鹤，周刚，程立坤*

(1.内蒙古科技大学 生命科学与技术学院，内蒙古 包头 014010；2.包头市农牧业科学研究院，内蒙古 包头 014010)

辣椒(CapsicumannuumL.)，茄科一年生草本植物，是一种药食同源蔬菜。辣椒原产于美洲，明朝末年传入我国后[1]，因其独特的口感深受人们的喜爱。辣椒中与辣味相关的物质统称为辣椒素(capsaicins)，最早由Thresh[2]从辣椒果实中分离出来。随后Bennet D J等[3]分析了辣椒素的化学组分，发现辣椒中的辛辣成分是由一系列同系物或相似物组成，它们被统称为辣椒素类物质。

辣椒素(反式-8-甲基-N-香草基-6-壬烯酰胺)又名辣素、辣椒碱，其分子结构式见图1，是一种无色片状结晶化合物。目前，人们已经发现20余种辣椒素类物质，其中辣椒素(69%)和二氢辣椒素(22%)含量最高，约占总含量的90%以上[4-6]。辣椒素通常由辣椒胎座合成，是一种常见的天然食品添加剂、辣味调味品。因其辛辣的风味，所以具有增加食欲、开胃消食等作用[7-8]。此外，辣椒素还具有抗癌[9-10]、抗疲劳[11]、长效镇痛[12]、抗病虫害[13]等作用。

图1 辣椒素分子结构式Fig.1 The molecular structure formula of capsaicins

辣椒素的含量及辣度(Scoville Heat Unit，SHU)的高低是评价辣椒品质及其制品质量的重要依据。目前市场上的辣椒没有鲜明的辣椒素及辣度分级标识，这会混淆辣椒的加工方式、方法，从而影响辣椒加工产品的风味。本文测定了包头本地自选育的19种加工辣椒的辣椒素含量并对其进行了辣度分析，从而得出不同辣度辣椒适合的加工方法，希望为辣椒、辣椒制品及辣椒的良种选育和原料加工提供重要的参考依据[14]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

本实验的辣椒材料均采自包头市农牧业科学研究院，辣椒品种栽培管理方法条件一致。实验样品一致性较好，表面无创伤，无明显病虫危害。样品采摘后立即储存于-18 ℃冷冻室内。

辣椒素标准品(≥99%)、二氢辣椒素标准品(≥99%)：均采购于上海源叶生物科技有限公司；乙腈(色谱纯)、甲醇(色谱纯)：采购于上海麦克林生化科技有限公司。

DHG-9023A电热鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司；MC8S-1A微波萃取仪 南京汇研微波系统工程有限公司；UV-7504紫外分光光度计 上海欣茂仪器有限公司；Thermo U3000超高效液相色谱仪 赛默飞世尔科技(中国)有限公司；JA5003电子天平 上海佑科仪器仪表有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 辣椒素的提取

辣椒素的提取参考孙胜枚[15]的方法略加改良。辣椒去籽、去梗，于60 ℃恒温干燥箱中烘干，粉碎过40目筛，备用。称取上述辣椒粉末5 g于250 mL 锥形瓶中，加入60 mL 80%的乙醇溶液微波300 W提取20 min，旋转蒸发得辣椒素粗制品[16]。

1.2.2 辣椒素的纯化

称取100 g D101大孔树脂，用95%乙醇浸泡24 h后，采用湿法装柱。用乙醇冲洗树脂，直到流出液加水变澄清，再用蒸馏水冲洗乙醇，直到无乙醇味[17]。用2～4 BV 10%盐酸冲洗，浸泡3 h，用蒸馏水冲洗，直到流出液pH变为5～7。用2～4 BV 7%氢氧化钠冲洗，浸泡3 h，用蒸馏水冲洗，直到流出液pH变为5～7。辣椒素粗提液过滤后，沿壁缓慢倒入树脂，待吸附平衡后用7.5 BV 80%乙醇以1 mL/min的速度洗脱[18]。

1.2.3 辣椒素的测定

1.2.3.1 辣椒素标曲的测定[19]

称取1 mg辣椒素标准品和二氢辣椒素标准品，经乙醇溶解后定容至10 mL作为储备液(浓度1 mg/mL)。吸取储备液0.01，0.02，0.04，0.06，0.08，0.1，0.12 mL于10 mL容量瓶中，用乙醇定容，配制成质量浓度为10，20，40，60，80，100，120 μg/mL的辣椒素和二氢辣椒素标准溶液，待HPLC进样检测分析。

1.2.3.2 色谱条件

AcclaimTMC18色谱柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)，柱温：30 ℃，流动相：水-乙腈(30∶70，V/V)，流速：1.0 mL/min，检测波长：280 nm，进样量：10 μL，运行时间：40 min[20]。

1.2.4 辣椒辣度SHU的计算方式

辣椒辣度SHU的计算方法按下式进行计算：

SHU=(X1+X2)×(16.1×103)+(X1+X2)/90%×10%×(9.3×103)。

式中：X1为辣椒素含量，mg/g；X2为二氢辣椒素含量，mg/g；90%为辣椒素与二氢辣椒素折算为辣椒素类物质总量的系数。

SHU与辣度级别换算见表1。

表1 SHU与辣度级别换算Table 1 The conversion between SHU and spiciness level

2 结果与分析

2.1 辣椒素检测波长的确定

在200～340 nm波长范围内扫描辣椒素标准品(二氢辣椒素标准品)溶液，得到的紫外可见光谱扫描结果见图2。

由图2可知，辣椒素和二氢辣椒素的最大紫外吸收波长在230 nm和280 nm处。考虑到实验所使用的流动相为乙腈和水，乙腈的紫外截止波长在210 nm左右，在230 nm处检测杂质峰多，因此选择280 nm作为紫外检测器的检测波长。

图2 辣椒素(二氢辣椒素)标准品紫外可见光谱扫描图Fig.2 The ultraviolet visible spectra scanning diagram of capsaicins (dihydrocapsaicins) standard samples

2.2 标准曲线的绘制

由图3可知，二氢辣椒素标准曲线的回归方程为Y=0.0037X+2.2399，相关系数为0.9961，辣椒素标准曲线的回归方程为Y=0.0047X+2.2174，相关系数为0.9925，表明辣椒素和二氢辣椒素在10～120 μg/mL范围之间与吸光度有良好的线性关系，该方法可作为辣椒素和二氢辣椒素含量的分析方法。

2.3 辣椒素萃取条件的确定

微波萃取实验条件的优化主要包括溶剂、萃取功率、萃取时间、萃取温度和料液比的选择。由于辣椒素是热不稳定的香草基肽胺类化合物，在较高温度下容易挥发而损失，因此，萃取功率过高、萃取时间过长或者萃取压力过大都可能导致萃取产率降低。

2.3.1 萃取溶剂的选择

为了高效快速地提取辣椒素，选取提取溶剂是至关重要的一步。根据辣椒素的物理性质，本实验选取甲醇、无水乙醇和丙酮3种溶剂进行了比较[21]，结果见图4。

图4 不同溶剂对提取效果的影响Fig.4 Effect of different solvents on the extraction effect

由图4可知，无水乙醇对辣椒素的提取率最高，丙酮次之，甲醇最小，且无水乙醇与丙酮和甲醇之间均存在显著性差异，故选择无水乙醇作为辣椒素及二氢辣椒素的提取溶剂。

2.3.2 乙醇浓度的选择

乙醇浓度不同，其对辣椒组织的渗透效果也会不同，因而对辣椒素的提取效果也会有所差异。由图5可知，70%的乙醇提取效果最佳，乙醇浓度较低，辣椒素不能充分溶出；乙醇浓度较高，辣椒素得率较低，故选择70%的乙醇作为提取溶剂。

图5 乙醇浓度对提取效果的影响Fig.5 Effect of ethanol concentration on the extraction effect

2.3.3 微波功率的选择

初步选择萃取时间为10 min、萃取温度为30 ℃、料液比为1∶5，以70%的乙醇作为提取溶剂，考察了微波功率对辣椒素萃取的影响，结果见图6。

图6 微波功率对提取效果的影响Fig.6 Effect of microwave power on the extraction effect

由图6可知，当微波功率达到200 W时，辣椒素和二氢辣椒素的提取含量都达到最大。因此，本实验选择微波萃取功率为200 W。

2.3.4 微波提取时间的选择

控制萃取时间的目的是为了控制加热程度，使萃取在最佳条件下进行以获得最大产率。选择萃取功率为200 W、萃取温度为30 ℃、料液比为1∶5，以70%的乙醇作为提取溶剂，考察了萃取时间对辣椒素产率的影响，结果见图7。

图7 微波提取时间对提取效果的影响Fig.7 Effect of microwave extraction time on the extraction effect

由图7可知，辣椒素的含量随着萃取时间的延长而升高，当萃取时间达到30 min时，产率最大。此后，随着萃取时间的增加产率降低，故选择微波萃取时间为30 min。

2.3.5 微波提取温度的选择

根据辣椒素的物理性质，辣椒素会随着温度的升高而挥发，因此控制萃取温度以求获得最大产率。萃取条件控制在微波功率200 W、萃取时间30 min、料液比1∶5，以70%的乙醇作为提取溶剂，考察萃取温度对辣椒素含量的影响，结果见图8。

图8 温度对提取效果的影响Fig.8 Effect of temperature on the extraction effect

由图8可知，当温度为30 ℃时，得率达到最大值。温度再升高得率明显降低。所以，本实验选定30 ℃为提取温度。

2.3.6 料液比的选择

合适的料液比能提高辣椒素的得率，为了得到辣椒素的最佳得率，本实验以70%的乙醇作为提取溶剂，在微波功率200 W、萃取时间30 min、萃取温度30 ℃的条件下考察了不同料液比对辣椒素得率的影响，结果见图9。

由图9可知，料液比对得率的影响较大。当料液比减少时得率迅速上升，但当料液比达到1∶15时得率增加不再明显，固液之间交换基本达到平衡。为节约溶剂且便于回收，本文选择1∶15作为提取料液比。

图9 料液比对提取效果的影响Fig.9 Effect of solid-liquid ratio on the extraction effect

2.4 正交实验设计

为进一步确定提取辣椒素的最优工艺条件，在上述实验的基础上选择乙醇浓度、提取功率、提取时间、料液比设计正交实验，研究其对辣椒素提取效果的综合影响。因素水平安排结果见表2～表4。

表2 辣椒素和二氢辣椒素提取工艺L9(34)正交实验因素水平表Table 2 The factors and levels of L9(34) orthogonal experiment for extraction process of capsaicins and dihydrocapsaicins

表3 辣椒素和二氢辣椒素提取工艺L9(34)正交实验结果Table 3 L9(34) orthogonal experiment results for extraction process of capsaicins and dihydrocapsaicins

由正交实验分析可知，影响辣椒素和二氢辣椒素得率的反应条件中各因素主次顺序为C>A>B>D，即微波功率>乙醇体积分数>微波时间>料液比。C因素中k3>k1>k2，因此C因素的优水平为C3，同理可分析A、B、D的优水平分别为A3、B1、D1。故辣椒素提取的最优水平组合为A3B1C3D1，即最佳工艺条件为乙醇体积分数80%、提取时间20 min、微波功率300 W、料液比1∶12。

表4 辣椒素和二氢辣椒素含量方差分析Table 4 Analysis of variance of content of capsaicins and dihydrocapsaicins

2.5 不同品种辣椒素及二氢辣椒素含量

2.5.1 HPLC测定标准曲线

由图10可知，辣椒素标准曲线的回归方程是Y=0.0837X+1.5245，相关系数为0.9941，表明辣椒素在10～100 μg/mL范围之间与吸光度线性关系良好。二氢辣椒素标准曲线的回归方程是Y=0.063X+0.0383，相关系数为0.9991，表明二氢辣椒素在2～50 μg/mL范围之间与吸光度有良好的线性关系。

2.5.2 对照品和样品色谱分离图

该色谱条件下，辣椒中辣椒素和二氢辣椒素得到很好分离，保留时间一致，辣椒素的保留时间约为5.3 min，二氢辣椒素的保留时间约为6.5 min，结果见图11。

2.5.3 HPLC检测辣椒素类物质含量

按照上述正交实验得出的提取方法对19种辣椒进行辣椒素和二氢辣椒素的提取，通过HPLC进行检测，结果见表5。

表5 辣椒素和二氢辣椒素含量Table 5 The content of capsaicins and dihydrocapsaicins mg/g

续 表

由表5可知，CF-21、HN1906-3、奥黛丽及先甜1号中并未检测出辣椒素及二氢辣椒素，这类辣椒属于甜椒或菜椒。剩余品种辣椒中辣椒素类物质含量最高的是艳椒425，其含量为0.353 mg/g，辣椒素类物质含量最低的是TL 8-1-2，其含量为0.021 mg/g。

2.6 19份辣椒辣度等级分布

由表6可知，19份辣椒材料中辣椒辣度主要集中在1～5级，其中1级辣椒的出现频次最高，占比31.57%；其次是3级辣椒的出现频率，占比26.31%，这类辣椒辣味比较醇厚，适用于火锅及串串香底料等；最后出现频率较高的是辣度级别为4的辣椒，占比15.78%，这类辣椒辣味比较突出，比较适合加工辣椒红油。

表6 19份辣椒辣度与辣度等级分布Table 6 The distribution of spiciness and spiciness levels of 19 kinds of peppers

3 结论

我国辣椒的种类繁多，但其辣椒素及辣度分级标识过于笼统，导致同一产品的口味出现差异，从而约束了辣椒产业的发展。实验对包头本地自选育的19种加工辣椒的辣椒素类物质进行HPLC检测和辣度分析，结果得出：艳椒425、沙尔沁辣椒辣椒素类物质含量较高，分别为0.353 mg/g和0.314 mg/g，其辣度达到6级，说明艳椒425和沙尔沁辣椒能够用作辣椒素提取候选品种之一，此外，此类较辣的品种还能够用来制作辣味火锅配料、泡椒、干辣椒等。实验发现TL 8-1-2辣椒素类物质含量最低，为0.021 mg/g，辣度为1级，由于此类辣椒辣味较低，通常用作鲜食蔬菜来品尝其独特的风味而不用作调味料。而411-2、366-3和博辣红星辣椒辣度为4级，这类辣椒常被用来酱制或油制。此外，未检出辣椒素的辣椒品种，其属于甜椒一类，这类辣椒口感微甜，通常被当作水果鲜食。

总之，不同品种辣椒辣椒素含量和辣度也不尽相同，其用途极为广泛，具有广阔的发展市场。