发酵法提取葡萄皮渣中可溶性膳食纤维的研究

刘俊红，林青青，刘瑞芳，张苗玉，王锟宇

(1.河南城建学院 生命科学与工程学院，河南 平顶山 467036；2.中国矿业大学 电力与动力工程学院，江苏 徐州 221116)

膳食纤维(Dietary Fiber，DF)是一种多糖，不能被肠道吸收，也不提供能量。研究表明，膳食纤维具有预防便秘和结肠癌，降低血糖，预防糖尿病，降低血清胆固醇，预防冠状动脉硬化等功能[1-3]。将膳食纤维作为食品添加剂添加到饮料中，可改善饮料的口感，例如可口可乐、雪碧等碳酸饮料都推出了“纤维+”等产品，满足了功能性食品的需求，成为当前饮料加工的一个新的发展方向[4]。

葡萄作为我国大宗消费水果，除了鲜食还可生产出各种深加工产品，在加工过程中产生的葡萄皮渣大部分都用作肥料，利用率低[5-8]。提取葡萄皮渣中的可溶性膳食纤维的方法很多，如酸法、活性酶法、发酵法等[9-11]。化学法操作方便但副产物多，影响提取物的含量，同时污染环境[9]；酶法虽然污染小，但成本投入高，不利于大规模生产[12]；发酵法污染小、产率高，制得的膳食纤维色泽、质地、气味、分散程度、持水力和得率均优于化学法[13-14]。虽然酶法、膜过滤和发酵法提取膳食纤维的技术尚不成熟，但反应条件温和，对环境的污染相对较小[15]。

目前，国内外提取膳食纤维以化学法为主，研究膳食纤维起步较早的国家，都在积极探索采用较为温和的工艺方法提取分离膳食纤维[16-18]。

本文以葡萄皮渣为原料，可溶性膳食纤维(SDF)的得率为指标，探究发酵法提取葡萄皮渣中可溶性膳食纤维的工艺条件，为葡萄皮渣的综合利用提供依据。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

葡萄皮渣：平顶山市德秀葡萄酒厂生产葡萄酒后的葡萄皮渣，干燥粉碎过60目筛备用。

1.2 主要试剂

95%乙醇(分析纯)：洛阳化工厂；氢氧化钠(分析纯)：西陇化工股份有限公司；保加利亚乳杆菌(CICC6045)：广东省微生物菌种保藏中心；嗜热链球菌(IFFI6038)：广东省微生物菌种保藏中心。

1.3 主要试验仪器

ME204E电子分析天平：梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；SHP-250生化培养箱：金坛市盛蓝仪器制造有限公司；MJ-78A高压灭菌锅：施都凯仪器设备(上海)有限公司；DHG-9123A鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；DC-1044低速离心机：科大创新股份有限公司中佳分公司；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵：安徽予华仪器设备有限公司。

1.4 试验方法

将保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌冻干粉活化后扩大培养，接种到葡萄皮渣粉配制的培养基中。利用微生物发酵的特点，使葡萄皮渣中的糖类、脂质、蛋白质等消耗，因这两种菌无法消耗降解纤维素，故可制得膳食纤维。

将2 g粉碎过筛的葡萄皮渣按照一定的料液比混合，加入2%脱脂奶粉、1.5%白砂糖并调至合适的pH值，接种发酵，分析发酵时间、pH、菌种接种量、料液比对试验结果的影响，每个单因素做五个梯度，三组平行。

1.4.1 菌种的扩大培养

本试验用的菌种是保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌[19]。

(1)保加利亚乳杆菌的活化

利用灭菌的MRS培养基37 ℃培养48 h。首次活化，干粉用尽量少的复水液溶解。

(2)嗜热乳酸链球菌的活化

采用灭菌的10%脱脂牛奶培养基，37 ℃培养48 h。冻干粉首次活化时，干粉用尽量少的MRS培养液溶解。

(3)扩大培养基：10%的脱脂牛奶培养基

1.4.2 单因素试验

(1)菌种接种量对葡萄皮渣中可溶性膳食纤维得率的影响

② 冷却至室温后分别接入菌种3.0%，混匀封口后放入恒温培养箱37 ℃培养24 h。

③ 培养结束后，将发酵液进行抽滤，取滤液，放入3倍体积78%乙醇后搅匀静置3 h，置于低温高速离心机中，室温下4 000 r/min离心10 min。所得沉淀55 ℃干燥至恒重后，记录试验结果即为SDF质量。

④ 依次将菌种接种量改为2.0%、2.5%、3.5%、4.0%，重复①～③的操作。

(2)pH对葡萄皮渣中可溶性膳食纤维得率的影响

依次将pH改为6.2、6.4、6.7、7.0、7.2，重复1.4.2(1)的试验。

(3)料液比对葡萄皮渣中可溶性膳食纤维得率的影响

(4)发酵时间对葡萄皮渣中可溶性膳食纤维得率的影响

依次将发酵时间改为16 h、18 h、20 h、22 h、24 h，重复1.4.2(1)的试验。

根据单因素试验结果，设计正交试验，探索发酵法提取葡萄皮渣中可溶性膳食纤维的最佳工艺[20]。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 菌种接种量对葡萄皮渣中可溶性膳食纤维得率的影响

不同接种量对葡萄皮渣中可溶性膳食纤维得率的影响见图1。

由图1可知，SDF得率先增高后缓慢降低，接种量在3.0%时葡萄皮渣中可溶性膳食纤维的得率最高。在菌种接种量为2.0%～2.5%时，可溶性膳食纤维的得率缓慢升高，说明接种量小的时候不能充分降解葡萄皮渣中的糖类、脂类、蛋白质等，在抽滤的时候部分生物大分子没有被抽滤下来；随着菌种接种量的增大，即接种量在2.5%～3.0%之间时，葡萄皮渣中的营养成分逐渐被菌种降解吸收，因此葡萄皮渣中可溶性膳食纤维的得率快速上升；在菌种接种量为3.0%时，SDF的得率最高，达到22.5%；当接种量在3.0%～4.0%时，SDF得率缓慢降低，变化趋于平缓，说明在既定的发酵液中，含量恒定的营养物质在较高的接种量下被降解殆尽，葡萄皮渣中的可溶性膳食纤维得率变化不显著。

2.1.2 pH对葡萄皮渣中可溶性膳食纤维得率的影响

pH对葡萄皮渣中可溶性膳食纤维得率的影响见图2。

图1 接种量对葡萄皮渣中可溶性膳食纤维得率的影响

图2 pH对葡萄皮渣中可溶性膳食纤维得率的影响

由图2可以看出，葡萄皮渣中可溶性膳食纤维得率先升高后降低，曲线的转折点在pH为6.4时，葡萄皮渣中可溶性膳食纤维得率最高。在pH为6.2～6.4时，葡萄皮渣中可溶性膳食纤维得率显著升高，pH为6.4时达到最大，说明此时的pH适合菌体的生长，各种酶的活性处于最高状态，对底物的消耗较为彻底，培养基中的可利用成分几近耗尽；在pH为6.4～7.2时，葡萄皮渣中可溶性膳食纤维得率逐渐下降，在pH为6.7后下降明显，说明pH过高，参与代谢反应的酶的活性受到抑制，酶促反应速率减缓，培养基中的营养成分降解率偏低，降低了葡萄皮渣中可溶性膳食纤维的得率。

2.1.3 料液比对葡萄皮渣中可溶性膳食纤维得率的影响

料液比对葡萄皮渣中可溶性膳食纤维得率的影响见图3。

由图3可知，料液比的增加使得葡萄皮渣中可溶性膳食纤维得率先升高后降低，料液比18时可溶性膳食纤维得率最高。

2.1.4 发酵时间对葡萄皮渣中可溶性膳食纤维得率的影响

发酵时间对葡萄皮渣中可溶性膳食纤维得率的影响见图4。

图3 料液比对葡萄皮渣中可溶性膳食纤维得率的影响

图4 发酵时间对葡萄皮渣中可溶性膳食纤维得率的影响

由图4可知，随着发酵时间的增加，可溶性膳食纤维的得率先增高后降低，20 h时达到最大，随后产物得率下降。发酵时间在16 h～20 h时，随着发酵时间的延长，菌种生长由延滞期进入对数期，比生长速率以指数级数增加，对底物的降解程度快速增加，表现为产物得率的持续上升；当发酵20 h时，底物的降解速率达到最大，此时产物得率最高；随着发酵时间的延长，经过对数期后，菌种的比生长速率趋于平缓，对底物的消耗速率下降；尤其是进入衰亡期后，菌种死亡速率增加，对底物的消耗程度下降，产物得率随之下降。

2.2 正交试验

在菌种接种量、pH、料液比、发酵时间四个单因素试验的基础上，确定菌种接种量3.0%、pH为6.4、料液比18、发酵时间20 h的基础上，使用正交软件设计正交试验，因素水平表和试验安排见表1和表2。

表1 正交试验设计的因素及水平

表2 正交试验安排与结果

续表2

由表2可知，影响试验结果的最敏感因素是pH，其次是料液比，在试验操作过程中应严格控制。

表2的试验结果显示：A1B2C2D2时可溶性膳食纤维的得率最高，即菌种接种量为2.5%，pH为6.4，料液比为18，发酵时间为20 h，此时葡萄皮渣中可溶性膳食纤维的得率高达29%。均值分析表明最优的工艺条件为A1B2C1D2，即菌种接种量为2.5%，pH为6.4，料液比16，发酵时间20 h。验证试验显示：A1B2C1D2时葡萄皮渣中可溶性膳食纤维得率为29.2%，略高于A1B2C2D2的得率。

3 结论与讨论

本研究以葡萄皮渣粉为原料提取SDF，试验结果显示：菌种接种量为2.5%，pH为6.4，料液比为16(g·mL-1)，发酵时间20 h时，葡萄皮渣中可溶性膳食纤维得率达到29.2%。

令博等[15]通过发酵法提取葡萄皮渣中的膳食纤维的工艺条件为发酵温度40 ℃、发酵时间21 h、接种量1%、料液比110，在此条件下SDF得率为(17.25±0.23)%；郭红珍等[16]用酶法提取葡萄皮渣中可溶性膳食纤维的最佳工艺为pH为7.0、50 ℃水浴条件下、加酶量50 μL·g-1，作用时间6 h，此条件下得到的可溶性膳食纤维为28.8%。