拟柱孢藻毒素生物合成的分子基础与进化特征

蒋永光，王志高，王纯波

(1.中国地质大学 环境学院，武汉 430074;2.中国科学院 水生生物研究所，武汉 430072)

水体富营养化和蓝藻水华的频繁暴发是工业化社会典型的重大环境问题，加之全球气候变暖对蓝藻生长的促进作用，蓝藻水华已经在世界范围内引起了广泛重视[1-2].水华蓝藻产生的蓝藻毒素给饮用水安全带来了极大风险[3].1979年，澳大利亚昆士兰州棕榈岛上的许多居民(多数是儿童)因为饮用水中毒突发肝因性肠炎.流行病学调查发现水源地暴发的拉氏尖头藻(原名拉氏拟柱孢藻，Raphidiopsisraciborskii)水华产生了致病性物质，导致了饮用水污染，该物质最终被鉴定为拟柱孢藻毒素(cylindrospermopsin，简称CYN)[4-7].小鼠腹腔注射实验表明，CYN的半数致死剂量(LD50)约为200 μg/kg体质量，在注射毒素5～6 d后发生致死效应[6].该毒素对肝脏、胸腺、肾脏和心脏等多个器官均有毒性，肝脏是主要的靶器官[8].在致毒机理方面，研究表明CYN能够抑制蛋白质、还原型谷胱甘肽以及尿嘧啶核苷酸的合成[9-11]，还会诱导DNA双链断裂，具有遗传毒性[12].有关CYN毒理的详细资料可以参考已经发表的综述[13-16].

CYN的化学结构主要由三环胍基、羟甲基尿嘧啶和硫酸基团组成(图1)，分子式为C15H21N5O7S(m=415 u)，是一种两性离子生物碱，具有水溶性[6].由于第7位碳原子(C7)是手性结构，CYN还存在一种对映异构体，即7-epi-CYN[17].此外，C-7缺少羟基修饰的CYN结构类似物称为脱氧拟柱孢藻毒素(7-deoxy-CYN)[18]，第12位碳原子(C12)的硫酸基团修饰也缺失的类似物称为脱氧脱硫拟柱孢藻毒素(7-deoxy-desulfo-CYN).C12上的硫酸基团被乙酰基取代的类似物是7-deoxy-desulfo-12-acetyl-CYN[19].毒理学实验表明7-epi-CYN与CYN有相似的毒性，而7-deoxy-CYN 未显示出毒性效应，因此，C7的羟基是产生毒性的必要结构，并且尿嘧啶基团也是产生毒性所必需的[17-21].

拉氏尖头藻水华原本主要发生在热带、亚热带地区.近年来，该种水华蓝藻在全球范围内快速扩散，其水华发生频次也不断增加[22-24].此外，在其他水华蓝藻，如弯形尖头藻(R.curvata)、地中海尖头藻(R.mediterranea)、鱼腥藻(Anabaena)、束丝藻(Aphanizomenon)和颤藻目的Kamptonema(原名Oscillatoria)中也陆续检测到了产CYN的藻株[25-33].迄今为止，除南极外，其他大陆的水体中均有检测到CYN的报道[34].该种毒素的污染及其引起的饮用水安全风险和生态风险也日益引起学术界和管理部门的广泛关注.CYN的合成与产量受到温度、光照以及氮、磷和硫元素的供应等多种环境因子的影响[35-41]，但是，由于不同研究者所用的藻株和实验条件的差异，得出的结论往往缺乏一致性.细胞内CYN的合成是由特定的毒素基因控制的[42].环境因子对毒素产生的调节作用都要通过影响毒素基因的表达或酶的活性来实现.

蓝藻等微生物含有丰富的次级代谢产物.这些结构多样的化合物的生物合成往往是由一系列的酶催化反应完成的，包括众多具有多个结构域的多功能酶，以及一般的代谢酶和修饰酶[43-44].这些合成酶的编码基因多数在基因组上彼此毗邻，甚至共用一个转录起始位点，这种特殊的基因排列称为基因簇(gene cluster).非核糖体肽合成酶(non-ribosomal peptide synthetase,NRPS)和聚酮合酶(polyketide synthase,简称PKS)是参与蓝藻毒素分子骨架构建的两类主要的多功能酶.NRPS的基本结构包括氨酰基腺苷酸化域(A)、肽键缩合域(C)和肽基载体蛋白(PCP)3个部分，分别具有特异性氨基酸激活、肽链延长和肽基运载的功能.另外，NRPS还含有氨基转移酶(AMT)和差向异构酶(Ep)等修饰酶结构域.PKS的基本结构包括酰基转移酶(AT)、β-酮合成酶(KS)和酰基载体蛋白(ACP)3个部分，还常含有酮还原酶(KR)、脱氢酶(DH)、烯酰基还原酶(ER)和甲基转移酶(MTF)等修饰酶结构域.处于链延长反应末端的NRPS和PKS还含有硫酯酶(TE)结构域，具有释放成熟化合物的功能.

为了便于从分子水平上加深对CYN产生的了解，建立有效的分子手段用于产毒藻(如无特殊说明，下文所说的产毒藻均指产CYN及其结构类似物的藻株)的检测和评估水体藻类产毒潜力及其与环境因子的关联性，本文结合作者前期的研究工作积累，对CYN合成基因及其进化特征的研究进展进行系统总结.

1 CYN合成的分子机理

1.1 CYN的合成基因

MIHALI等首先从产毒藻株R.raciborskiiAWT205中扩增出了完整的CYN合成基因簇(cyrcluster)[42]，全长43 kb，含有15个开放阅读框(图2A)，包括：脒基转移酶基因cyrA，NRPS/PKS杂合基因cyrB，4个PKS基因cyrC～cyrF，胞嘧啶脱氨基酶的同源基因cyrG和cyrH，磺基转移酶基因cyrJ，羟基化酶基因cyrI，钠离子转运蛋白的同源基因cyrK，腺苷酰硫酸激酶基因cyrN，推测的调控因子cyrO，以及不参与毒素合成的转座酶基因cyrL和cyrM.在产毒藻R.raciborskiiCHAB3438[45]、R.curvataCHAB1150[46]、Aphanizomenonsp.10E6[47]和Kamptonemasp.PCC 6506[30]的cyr基因簇中未发现cyrN和cyrO(图2).MAZMOUZ等认为cyrN基因是参与硫元素基础代谢的持家基因，并非特异性的毒素基因[30].但是，JIANG等通过对尖头藻中的产毒藻株和不产毒藻株进行基因检测和比较表明，cyrN仅存在于产毒藻株中，推测其是cyr基因簇特有的[45-46]，在尖头藻中还有另一个预测的腺苷酰硫酸激酶基因可能与基础代谢有关[48].此外，cyrO存在于所有尖头藻中，推测其不是cyr基因簇特有的[45-46]，但是cyrO是否参与毒素合成的调控仍不清楚.

1.2 CYN合成路径

同位素标记实验表明胍基乙酸分子能够整体嵌合到CYN分子骨架中[49]，因此，CYN可以看作是由胍基乙酸起始合成的聚乙酰链结构.毒素分子中的碳原子分别来源于甘氨酸，5个乙酸单位和一碳单位，尿嘧啶基团是毒素合成过程中形成的，并非直接来源于含尿嘧啶的底物[49].因此，CYN的合成过程是由NRPS和PKS参与完成的.MIHALI等根据同位素标记实验和生物信息学分析的结果，推测了图3所示的CYN合成路径[42].

1.2.1CyrA催化的起始反应

转脒基酶是将供体分子的脒基转移到受体分子的氨基上，形成胍基基团.精氨酸:甘氨酸转脒基酶主要存在于脊椎动物和植物中，是胍基化合物合成的关键酶，在脊椎动物能量代谢(如肌酸合成)和高等植物次级代谢物的合成中有重要作用[50-52].蛋白质模型分析表明CyrA与人类精氨酸:甘氨酸转脒基酶(AGAT)具有较高的结构相似性，且参与底物结合的氨基酸位点也高度保守，具有利用精氨酸和甘氨酸作为底物的结构特征[53].MUENCHHOFF在大肠杆菌中表达和纯化了CyrA，并加入精氨酸和甘氨酸进行体外酶活性表征，利用核磁共振氢谱鉴定出反应产物中含有胍基乙酸以及精氨酸脱去脒基后的鸟氨酸[54].底物类似物添加实验表明CyrA的底物特异性比AGAT更高，脒基供体的羧基是与酶蛋白结合时所必需的，进一步的点突变实验表明CyrA活性位点的第245和247位氨基酸对于底物特异性和活性位点稳定性至关重要[54-55].另外，CyrA催化反应的初始速率、中间产物和产物抑制特征表明该酶的反应动力学具有乒乓反应和随机顺次反应的双重特征，酶分别在pH 8.5和pH 6.5时具有最大活性和最大稳定性，其最适温度为32 ℃[54].此外，蛋白纯化鉴定的结果表明CyrA在细胞内以二聚体和四聚体形式存在[54].尽管体外实验提供了较为确凿的证据，BURGOYNE等在培养的产毒藻中未能检测到同位素标记的精氨酸脒基转移到胍基乙酸[49]，该结果可能是由于藻细胞不能摄取外源添加的精氨酸所致[53].另外，也有研究发现产毒藻和不产毒藻都可以积累胍基乙酸，说明蓝藻中还存在其他胍基乙酸生成途径[56].以上研究结果表明CyrA是第一个在原核生物中发现的精氨酸:甘氨酸转脒基酶，催化CYN合成的起始反应，将精氨酸的脒基转移到甘氨酸的氨基上形成胍基乙酸[53-54].

1.2.2CyrB催化第一步碳链延长反应

在预测的参与碳链延长反应的5个多功能酶中(CyrB～CyrF)，只有CyrB含有NRPS的A结构域(CyrB-A)，具有结合并激活起始底物的功能.但是，已知的A结构域都不能利用胍基乙酸作为底物[42].通过比较多种A结构域底物结合区的氨基酸残基，KELLMANN等发现A结构域的第一个位点都是天冬氨酸，可以与底物氨基酸的α氨基形成氢键，第8个位点一般是疏水性氨基酸，但CyrB-A是天冬氨酸，推测CyrB-A的两个天冬氨酸有可能与胍基乙酸的2个氨基形成氢键，从而促进该底物的识别和结合[53].利用短杆菌肽合成酶(GrsA)的结构模型对CyrB-A进行的建模分析也表明胍基乙酸能够嵌入到其底物结合区[53].CyrB-A激活胍基乙酸后，可通过PCP的摆动臂将其转移到KS结构域.与此同时，AT结构域激活一分子丙二酰CoA，使其结合到ACP上，在KS催化下与胍基乙酸发生缩合反应，完成第一个乙酸单位的添加.

CyrB的KR和DH结构域可以协同催化将来源于胍基乙酸的酮基还原并脱水，形成第13位和14位碳原子之间的烯键(C13=C14).CyrB的MTF结构域与S-腺苷甲硫氨酸依赖的甲基转移酶同源，预测其催化了C13的甲基化.同位素标记实验也证实C13上的甲基来源于S-腺苷甲硫氨酸[49].此外，用氘代乙酸作为C13前体的实验也表明CYN合成过程中C13上的全部氘原子均被去除，最后产物分子中C13上的氢原子是反应过程中添加的，间接证明了上述反应过程推测的合理性.

CYN分子中三环结构的形成机制尚不清楚，CyrB催化的反应完成后，线性产物可能直接进入下一步碳链延长反应[53].MIHALI等提出CyrB催化反应的产物可能发生环化，即第19位脒基氮可以通过“Michael加成反应”的方式亲核攻击上述烯键，并与C14键合，生成CYN分子骨架中的第一个环状结构，即五元含N杂环[42].根据鲍德温规则，这一分子内关环反应在能量上是有利的，可以在无酶催化的条件下随机发生[57].

1.2.3PKS催化添加4个乙酸单位

毒素合成基因簇编码了4个PKS，其中CyrC包含KS,AT,KR,ACP 4个结构域，能够在链延长反应后还原酮产生一个羟基.CyrD和CyrE均包含KS,AT,KR,DH,ACP 5个结构域，都能够在链延长反应后还原酮并脱水产生一个烯键.CyrF仅包含KS,AT,ACP 3个结构域，链延长反应产物含有2个酮基.根据酶反应产物的特征、CYN的化学结构和同位素标记实验结果可以推测催化反应顺序依次为CyrC,CyrD和CyrE,CyrF[42].

首先，同位素标记实验表明CYN的C12上单键键合的氧原子来自乙酸前体，是由酮基还原产生[49].氘代乙酸培养实验也表明CYN合成过程中C11上的2个氘原子都没有丢失，说明C11没有经历脱氢反应[49].这两个结果表明，C11与C12键合后的产物只发生了酮基还原，符合CyrC的催化反应特征.因此，可以推测CyrB催化反应的产物转移到了CyrC的KS结构域，在其催化下添加第2个乙酸单位，随后CyrC的KR结构域催化C12位上的酮基还原成羟基.

CyrD和CyrE具有相同的结构域组成，尚不清楚二者的反应顺序.以CyrD为例，其KS结构域结合CyrC催化反应的产物，催化添加第3个乙酸单位.CyrD的KR和DH结构域依次催化C10位上的酮基还原和脱水形成烯键(C9=C10).氘代乙酸培养实验表明CYN合成过程中C9上仅保留了1个氘原子，证明C9确实经历了脱氢反应[49].CyrD催化反应产物的第19位脒基氮可以通过“Michael加成反应”的方式亲核攻击上述烯键，并与C10键合，生成CYN分子骨架中的第2个环状结构，即六元含N杂环[42].

CyrE的KS结构域结合上述含有并环的产物，催化添加第4个乙酸单位.其KR和DH结构域依次催化C8上的酮基还原和脱水形成烯键(C7=C8).氘代乙酸培养实验表明CYN合成过程中C7位上的氘原子均被去除，证明C7确实经历了脱氢反应[49]，并且C7位的羟基也不是来源于乙酸，而是在修饰酶催化下添加的.CyrE催化反应产物的第18位氮也可以通过“Michael加成反应”的方式亲核攻击上述烯键，并与C8键合，生成CYN分子骨架中的第2个六元含N杂环[42]，CYN的三环结构得以形成.这一中间产物与CyrF的KS结构域结合，在其催化下添加第5个乙酸单位，产物的C4和C6上各有1个未被还原的酮基.

1.2.4CyrG和CyrH催化尿嘧啶环的形成

同位素分析表明C4上的氧原子来自乙酸前体，说明尿嘧啶环是在毒素合成过程中形成的，是一种新的尿嘧啶合成途径.该途径包括C4和C6共同与1个脒基的2个氮原子键合[42,49].CyrG和CyrH具有较高相似度，均是胞嘧啶脱氨基酶的同源蛋白，表明二者与氮碳键的形成有关，且催化相似的反应.因此，CyrG和CyrH有可能催化了第2个脒基与碳链的键合反应.当脒基的第1个氮与C6键合时，C6上的羟基在脱水反应中被去除，并形成1个烯键(C5=C6).脒基的第2个氮与C4键合，同时伴随着中间产物分子与CyrF-ACP之间硫酯键的断裂，该产物就是7-deoxy-desulfo-CYN.由于CyrF缺少TE结构域，不能催化硫酯键的水解，间接表明了上述反应过程推测的合理性.由于产物分子中脒基碳(C2)上是羰基，脒基的供体可能是尿素分子或者含胍基的化合物(如精氨酸)，胍基供体的碳链以类似脱氨的方式与脒基分离，该反应可能也是由CyrG或CyrH催化的.

1.2.5CyrJ和CyrN协同催化7-deoxy-desulfo-CYN的硫酸化

在CYN的结构类似物中，7-deoxy-CYN应当是由7-deoxy-desulfo-CYN经硫酸化反应生成的，推测CyrJ催化磺基转移到7-deoxy-desulfo-CYN的C12羟基，生成7-deoxy-CYN[42].CyrN催化的产物3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸(PAPS)为CyrJ提供活化的硫酸基团.另一结构类似物7-deoxy-desulfo-12-acetyl-CYN是在C12羟基上键合了乙酰基，其生成机制尚不清楚，推测是O-酰基转移酶催化了这一反应[58].已知的cyr基因簇中都没有编码这种酶的基因，因此，需要对发现这一化合物的藻株进行基因组测序分析，以期确定O-酰基转移酶的来源.

1.2.6CyrI催化7-deoxy-CYN的羟基化

CyrI与2-酮戊二酸依赖的铁氧化酶(2-ODIO)同源，而2-ODIO在真核和原核生物中广泛存在，催化各种氧化反应.将CyrI的蛋白序列与2-ODIO进行比对，可以发现CyrI的二级结构中含有在2-ODIO中高度保守的二价铁和2-酮戊二酸结合区域，说明CyrI具有氧化酶的特征[59].体外表达和酶催化实验表明CyrI能够催化7-deoxy-CYN 的C7羟基化生成CYN或7-epi-CYN[59].此外，CyrI不会将C7的羟基氧化成酮，也不具有差向异构酶的活性，不能介导CYN和7-epi-CYN的转变[59].对于CyrI催化产生两种手性异构体CYN或7-epi-CYN的机制，MAZMOUZ等[59]调查了不同产毒藻的CyrI蛋白序列相似度，以及手性异构体的含量和比例，发现CyrI蛋白可以分成两种基因型，分别对应于高比例的CYN和7-epi-CYN.因此，CyrI蛋白依其本身的序列和结构特征具有一定的立体选择性，二级结构中的1个α-螺旋可能是立体选择性的调控元件[60].JIANG等分离鉴定了含有CyrI天然碱基突变和插入突变的产毒藻株，这些藻株只能合成7-deoxy-CYN，为CyrI功能的鉴定提供了进一步的证据[45-46].另一种蓝藻毒素石房蛤毒素的合成基因簇也编码了类似CyrK的转运蛋白，SxtF和SxtM，研究表明藻细胞能够在钠离子和钾离子诱导下排出石房蛤毒素，恰好与这两个蛋白的功能相一致[61].因此，推测CyrK也具有辅助藻细胞响应盐离子排出毒素的功能，但是还需要实验验证.另外，JIANG等分离了具有单碱基缺失的CyrK的产毒藻株，这些藻株的CyrK的C端缺失了部分氨基酸，但是毒素的排出并未被阻断，可能C端部分氨基酸缺失不会显著影响CyrK的功能[45].

2 CYN合成基因表达的调节

澳大利亚拉氏尖头藻的cyr基因簇缺少明显的启动子区域，且在基因组上定位于氢化酶基因簇(hyp)中[42,62]，而hyp基因的表达受到氮代谢调控因子(NtcA)的调节[63]，推测cyr基因簇可能也受到NtcA调控.NtcA能够激活氮同化基因，这与拉氏尖头藻在缺氮条件下毒素含量最高的结果相一致[64].此外，在从中国水体中分离的产毒尖头藻中，只有cyrN位于hyp中，cyr基因簇主体已经转移到了基因组的其他位置[45].尽管如此，这些藻株仍表现出了受NtcA调控的特征，在缺氮条件下产毒量明显增加[65].毒素产生还与固氮作用相关，缺氮和富磷的组合条件下拉氏尖头藻的生长率增加，固氮作用增强，毒素合成量也增加[66].

SHALEV-MALUL等发现在缺氮条件下束丝藻的细胞内毒素含量明显减少[37]，但该研究没有测定释放到细胞外的毒素.由于胞外毒素最高可能占到总毒素的50%以上，尚不能确定束丝藻产毒过程对氮供给的响应特征[65].在束丝藻中，反向转录的cyrA和cyrC基因各有2个转录起始位点.在缺氮和高光的胁迫下基因转录起点不同，其表达量比氮充足和低光时较低，毒素的产量也较低，但与基因表达量的变化程度不完全一致，说明毒素合成还受到转录后调控[37].与cyrA和cyrC的启动子区特异结合的AbrB蛋白(细胞转换态调控因子)也已经被分离出来，推测其参与了转录调节过程[37].然而，如图2所示，在尖头藻和颤藻中cyrA和cyrC的间隔区已经被破坏，AbrB蛋白是否还能结合到新的启动子区还有待研究.另外，BAR-YOSEF等还发现椭胞束丝藻(Aphanizomenonovalisporum)毒素基因的表达量在缺磷条件下升高，相应的毒素产量也增加[41].但在拉氏尖头藻中，毒素基因的表达相对稳定，不受磷缺乏的影响，毒素产量与生长率正相关，在低磷条件下产量也低[67].因此cyr基因的表达调控模式在不同藻株中存在差异，即具有藻株特异性.

3 CYN合成基因的进化特征

微生物次级代谢产物与其生物学和生态学功能密切相关[43]，蓝藻毒素合成基因的进化过程可以基于其现生阶段的某些生理作用做简单推测，但是缺少确凿的证据.尽管如此，研究者仍可以根据毒素合成基因簇的排列模式和序列变异来对其进化特征进行分析[68].例如，微囊藻毒素合成基因与16S rRNA基因具有共进化特征，结合产微囊藻毒素种类已知的最早化石记录，推测微囊藻毒素的起源早于后生动物，因此，该毒素并不是蓝藻在抵御后生动物捕食过程中进化出来的[69].

3.1 cyr基因簇的重排现象

目前已经报道的产CYN藻的cyr基因簇在基因组上的排列方式具有明显的地域性和种间差异(图2).从澳大利亚分离的拉氏尖头藻均具有图2(A)所示的基因簇结构[42,62]，而从中国水体分离的尖头藻均具有图2(B)或图2(C)所示的cyr基因排列方式[45-46].尖头藻和束丝藻均属于念珠藻目，在这些产毒藻中，cyr基因簇整体上是由4个模块片段按不同的排列顺序构成，包括2个多顺反子片段：S1(cyrA-cyrB-cyrE)和S2(cyrD～cyrK)，以及单基因片段S3(cyrC)和S4(cyrN).因此，藻株的基因簇排列方式可以分为3种，以R.raciborskiiAWT205为代表的S2-S1-S3-S4，以R.raciborskiiCHAB3438为代表的S1-S3-S2和S4，以Aphanizomenonsp.10E6为代表的(S3-S2)(反向互补)-S1.不同藻株片段衔接位点的序列高度相似，说明以上cyr基因簇是由共同的原始结构形式重排产生.在Kamptonemasp.PCC 6506中，S2被分割成了不同的部分，分布于S1和S3的上下游.在Aphanizomenonsp.10E6和Kamptonemasp.PCC 6506中检测到的腺苷酰硫酸激酶与CyrN相似度过低，不能确定其是否属于cyr基因簇的S4.总体上，念珠藻目种类的cyr基因排列非常相似，具有一定的同线性(synteny)，并与颤藻的cyr基因排列高度分歧.毒素基因簇结构的差异程度与产毒藻的分类学差异相一致，表明cyr基因簇可能起源于蓝藻祖先类群，在进化过程中发生了重排现象[45-47].

从图2可以看出，在cyr基因簇中分布有较多的转座酶及其残余序列，这说明转座机制可能介导了cyr基因簇的重排.JIANG等发现R.curvataCHAB1150的cyrI基因中存在转座酶插入导致的基因失活，进一步证明了转座酶在基因簇进化过程中的关键作用[46].澳大利亚拉氏尖头藻的cyr基因簇定位于hypF和hupC基因之间[62]，中国拉氏尖头藻和弯形尖头藻的cyr基因簇主体部分定位于基因组其他位置，只有cyrN还留在这一位点[45].因此，在中国的两种尖头藻中，cyr基因簇主体部分发生了相似的基因组内位置转移.系统发育分析表明中国水体和澳大利亚水体的产CYN拉氏尖头藻可以聚成一类，弯形尖头藻则形成独立的分枝[48].这些结果表明cyr基因簇的位置转移可能在尖头藻祖先类群中就已经发生，而澳大利亚藻株的cyr基因簇主体部分可能经历了第2次位置转移，又回到了hypF和hupC基因之间.

3.2 cyr基因的保守性

基于产毒藻的cyr基因和16S rRNA基因所做的系统发育树总体上是一致的，其拓扑结构与产毒藻分类地位相一致.这种一致性也对应了产毒藻株间cyr基因簇结构的共线性现象[45].因此，cyr基因与16S rRNA基因在一定程度上具有共进化的关系.但是，与16S rRNA基因的系统树相比，在cyrA基因以及cyr基因串联簇的系统发育树中[45,53]，念珠藻目种类以更低的分歧度聚成一类，其cyr基因的相似度也要等于或高于16S rRNA基因，表明cyr基因在念珠藻目中具有高度的保守性[46-47].与之相反，念珠藻目产毒藻和颤藻在系统树上具有明显分歧，cyr基因的相似度也低于16S rRNA基因.

基因水平转移(HGT)和净化选择是影响基因保守性的2个重要因素.STUCKEN等发现产毒藻在蓝藻系统树上的分布是随机的，由此认为cyr基因是通过HGT在产毒藻中传播的[70].在拉氏尖头藻和束丝藻中，cyr基因簇与基因组上的相邻区域相比具有较高的GC含量，进一步证实了HGT事件的可能[47].因此，念珠藻目产毒藻之间cyr基因的高度保守性可能是HGT事件的结果[45].另外，尽管念珠藻目种类的CyrK蛋白序列高度相似并与颤藻差异显著，但是Aphanizomenonsp.10E6与Kamptonemasp.PCC 6506在相对更多位点上有相同的氨基酸，这些位点的氨基酸很有可能是从祖先蛋白继承来的.也就是说束丝藻比尖头藻更接近祖先产毒藻，因而推测cyr基因簇可能是从束丝藻转移到了尖头藻.此外，颤藻中cyrI基因的2种基因型在产毒藻株中的分布与藻株之间的系统发育距离并不一致[59]，推测cyr基因在颤藻中也是通过HGT传播的[59].图4显示了cyr基因簇可能发生的HGT事件，为了进一步验证HGT的可能，还需要对更多地理来源的产毒藻株进行cyr基因簇的测序分析.

通过分析蛋白质编码基因受到的选择压力也可以解释基因序列的保守性以及基因产物在维持细胞生命活动和环境适应中的重要性.净化选择经常是许多重要基因保守进化的机制[71]，这种机制也可能影响了念珠藻目种类而非颤藻的cyr基因.JIANG等发现cyr基因的重组位点稀少且不具有显著性，这与序列本身的保守性相一致[46].另外，cyr基因受到的选择压力并不一致，NRPS/PKS基因显著偏离中性进化，并存在较多的负选择位点，推测这些基因受到净化选择，但是在局部的进化分枝上也存在少量正选择的位点[45].YILMAZ等利用环境DNA进行PCR扩增，获得了美国佛罗里达州水体中椭胞束似藻的cyrB基因序列，发现其也受到净化选择[72].NRPS/PKS基因受到净化选择的内在机制尚不清楚.同种蓝藻中既有产毒种类，也有不产毒种类，毒素的有无对藻细胞生长和生理似乎并没有决定性作用.尽管如此，拉氏尖头藻的产毒株与非产毒株相比，其孔蛋白表达在缺铁条件下显著增强，对胁迫环境的耐受性也更强[73]，CYN可能介导了这种耐受性，但是还需要进一步的研究证据.此外，cyrA,cyrG,cyrH,cyrI,cyrJ以及cyrK整体上处于中性进化，但存在负选择和正选择的部分位点[45].

3.3 cyr基因的变异特点

JIANG等测定了中国淡水水体中的cyrI和cyrJ基因序列，并将这些环境序列与产毒藻的相应基因序列汇总起来，根据序列变异特征划分出了不同的基因型[45].对于cyrI基因，根据其插入序列和片段重复，可以分为4种类型(图5(A)).已知的多数产毒藻cyrI基因属于Itype1，其中部分序列含有碱基突变，并导致了基因内部的终止密码子和cyrI基因失活.与Itype1相比，Itype2和Itype3中多出的序列并没有改变基因的阅读框，只是在相应的蛋白质序列内部出现了寡肽的重复拷贝，这些增加的肽段是否影响了基因的功能尚不清楚.Itype4比Itype1多了一段插入序列，引起了基因内部的终止密码子和截断的蛋白序列，导致了cyrI基因失活.这些插入序列含有反向末端重复，属于典型的转座元件.Itype4af和Itype4ar的插入序列反向互补，推测是转座元件自身倒位形成的.Itype4b的插入序列内部包含一个完整的转座酶编码基因，证实了转座元件在基因变异中的关键作用.

根据cyrJ基因序列中重复片段数目和核苷酸缺失情况可以将其分为3种类型(图5(B)).其中Jtype2包括3种亚类型，Jtype2a含有两个完整的重复片段，Jtype2b的第一个片段缺失了6聚核苷酸，Jtype2c在第2个片段中缺失了6聚核苷酸.已知的产毒藻株的cyrJ基因分别属于Jtype2a和Jtype2c，毒素检测结果表明这两种亚类型均能催化硫酸化反应.与Jtype2比，Jtype1和Jtype3中重复片段的缺失和增加都没有改变基因阅读框，只是在相应蛋白质序列内部存在数目不同的寡肽重复拷贝，其酶活性特征还有待研究.

4 总结和展望

由于拉氏尖头藻等产CYN蓝藻尚缺乏有效的遗传操作手段，有关毒素合成的生物学机制的研究多是基于生物信息学和化学结构分析所做的推测，少数基因的功能通过体外表达实验得到了验证.天然突变体的鉴定和表征与反向遗传学手段类似，也可以验证目的基因的细胞内功能，cyr基因较高的突变率为研究其功能提供了一种新的途径.但是，天然突变体出现的概率与基因本身的特性有关，且总体较低，分离筛选工作量大.对CYN合成基因进化特征的分析表明，cyr并不是单一的进化路线，净化选择在部分基因中起到重要作用，HGT则影响了整个基因簇的进化过程.

根据国内外的研究进展，今后对CYN生物合成路径的研究应当着重在以下几个方向展开：分离纯化无细菌污染的拉氏尖头藻，建立可靠的反向遗传学操作体系，对毒素基因进行定向敲除和回补，并检测突变藻株的代谢产物，从而验证目的基因的确切功能，分析毒素结构形成的中间产物和实际过程；探究毒素合成的调控机制，通过生物信息学分析和基因突变定位调控元件；通过多种产毒藻在同等条件下的检测分析实验，确定影响毒素合成的环境因子；在全球不同地域分离产毒藻株，测定其cyr基因簇结构，分析产毒藻及其毒素的起源；根据合成生物学的理论和方法，利用毒素合成路径开展长链烷烃或含尿嘧啶化合物的生物合成研究.