鲁莱黑猪MYH3基因外显子突变搜寻及其与肌内脂肪的关联分析

徐 晶，王继英，周李生，郑仰清，张昌政，赵雪艳*，张廷荣*

（1.青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109；2.山东省农业科学院畜牧兽医研究所/山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室，山东济南 250100）

鲁莱黑猪是我国莱芜猪（具有代表性的中国地方猪品种）与约克夏猪杂交，经人工选育而成的新品种。该品种属肉脂兼用型猪种，其肉色泽鲜红、细嫩多汁，并以其肌内脂肪（Intramuscular Fat，IMF）含量高而闻名。IMF 含量对肉质有重要影响，人们普遍认为高IMF 含量可以显著提高猪肉风味。IMF 含量具有较高的遗传力，在品种之间和品种内均显示出显著的遗传差异。在鲁莱黑猪的群体当中，影响IMF 的基因也存在着一定程度的分离，并且SNP 标记和QTN 之间存在广泛连锁不平衡（Linkage Disequilibrium，LD）。因此，对猪IMF 的单核苷酸多态性和相关基因的鉴定，特别是利用IMF 含量变异较大的群体，有助于建立优化猪肉IMF 的分子育种工具，并揭示脂肪沉积的机理。由于肉质性状是当前养猪业核心育种目标之一，鉴别影响IMF 的因果突变和主效基因具有重要的经济价值和科学意义。在过去的20 年里，利用微卫星标记在猪身上发现了许多影响IMF 含量的QTL。随着高通量SNP 基因分型方法的发展，近年来，一些全基因组关联分析（Genome-Wide Association Studies，GWAS）在鉴定与包括IMF 含量在内的多种性状相关或潜在的遗传因素方面取得了实质性进展。熊信威等利用GWAS 分析揭示了中国莱芜猪肉质性状的遗传基因座和候选基因，其中就包括4个连锁的（Myosin Heavy Chain）基因。除此之外，CHO 等研究发现，基因通过影响肌纤维的组成而影响肌纤维特性，并且该基因启动子区的功能性调节突变（XM_013981330.2：g.-1805_-1810del,chr12：55 373 707）是影响猪的肌纤维类型组成和IMF 含量的因果突变。目前，国内外关于猪基因方面的研究较少，特别是在鲁莱黑猪等中国地方猪/培育猪群体中尚无相关研究报道。本实验通过验证功能性突变在鲁莱黑猪群体中对IMF的效应，同时在基因外显子中搜寻影响IMF 的显著性突变位点，从而给鲁莱黑猪肉质性状的选育提供潜在的分子标记，并为搜寻影响鲁莱黑猪群体IMF 的因果位点和主效基因奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 本实验研究对象为435 头鲁莱黑猪，其中公猪276 头，母猪159 头。所有猪只均来源于莱芜猪原种猪场，表型测定由山东省农业科学院畜牧兽医所完成。用耳号钳采集耳组织样，放置于装有75% 酒精的离心管中，用装有干冰的盒子带回实验室，-20℃冻存，用于提取鲁莱黑猪基因组DNA。

1.2 体重和IMF 含量的测定及DNA 的提取 屠宰时体重（BW）和IMF 的测定方法分别按照《瘦肉型猪胴体性状测定技术规范》（NY/T825-2004）和《猪肌肉品质测定技术规范》（NY/T 821-2004）进行。当鲁莱黑猪体重在70～100 kg 之间时进行屠宰，并从每头猪的最后一根肋骨收集约200 g 背最长肌，采用索氏石油醚萃取法测定IMF 含量。肌内脂肪含量（%）=［（浸提前烘干重－浸提烘干后重）／鲜肉样重］×100。

采用TIANamp Genomic DNA Kit 血液/细胞/组织基因组DNA 提取试剂盒（TIANGEN 生化科技公司）提取鲁莱黑猪耳基因组DNA。用SpectraMax QuickDrop超微量分光光度计对DNA 进行质量检测和浓度测定。A/A比值在1.8～2.0，A/A比值>2.0 评定为合格的DNA。合格的DNA 样品其浓度使用ddHO 统一稀释为20～50 ng/µL 范围内，用于后续实验。

1.3 引物设计合成和PCR 扩增 根据猪基因序列（Sscrofa11.1：CM000823.5），使用Premier 5.0 软件共设计了21 对引物，具体见表1。所有引物均由青岛擎科生物公司合成。对鲁莱黑猪基因外显子进行扩增。PCR 模板为根据IMF 含量的高低在435 头鲁莱黑猪中随机选取IMF 低、中、高、极高公母各2 头猪构建的8个DNA 混合池，标号为1～8 号。PCR 扩增总反应体系为25 μL：DreamTaqTM Green PCR Master Mix（2X） 12.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA 模板2 μL，ddHO 8.5 μL。PCR 扩增反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s、退火30 s、72℃延伸1 min，共35个循环；最后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR 产物用1%琼脂糖凝胶电泳分离。将条带明亮且单一的PCR 产物原液送由青岛擎科生物公司sanger 测序。

表1 MYH3基因外显子测序PCR 引物及反应条件

1.4 序列分析 采用DNAMAN、BioEdit 7.0 等生物信息学软件对鲁莱黑猪基因编码区序列进行拼接、氨基酸序列预测以及蛋白质分析。利用https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw 在线网站和GeneDoc软件对核苷酸序列和蛋白质序列进行比对分析。利用在线网站http://web.expasy.org/protparam/和Compute pI/Mw 软件预测蛋白质理化性质，CPHmodels 软件和Antheprot 3D viewer 软件预测蛋白质三级结构。实验中涉及的动物基因均从NCBI 数据库和Ensembl 下载，包括人（NM_002470.4）、倭黑猩猩（XM_034942369.1）、小鼠（XM_006532412.2）、大鼠（NM_012604.1）、绵羊（XM_027974881.1）和牛（NM_001101835.1）。

1.5 SNP 位点的搜寻及基因分型

1.5.1 PCR-RFLP 分析 根据CHO 等研究结果公布的猪基因启动子区域因果位点信息（XM_013981330.2：g.-1805_-1810del,chr12：55 373 707）以及Ensembl 网站查阅的基因序列信息，利用Premier 5.0 软件设计引物，引物序列为：F：5'-GGGCTACCTCCCTCTCA-3'，R：5'-GTTGTGGCAGGAATGTGT-3'，扩增目的片段长度约为143 bp。PCR 反应体系为25 μL:DreamTaqTM Green PCR Master Mix（2X） 12.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA 模板2 μL，ddHO 8.5 μL。PCR 扩增反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s、61℃退火30 s、72℃延伸1 min，共35个循环，最后72℃延伸10 min。鲁莱黑猪基因PCR 产物的HpyCH4IV酶切体系共25 μL：PCR原液10 μL，星选 酶HpyCH4 IV 0.5 μL，10×NEBuffer 2.5 μL，ddHO 12 μL。37℃温育15 min 后用3%琼脂糖凝胶电泳分离检测，进行基因型的确定。

1.5.2 SNP 位点搜寻及分析 将测序所得结果进行DNAMAN 和SeqMan 比对，同时对序列图谱进行峰图分析，找出基因外显子发生突变的SNP 位点。根据比对结果，重点对基因外显子中的错义突变位点进行生物信息学分析：采用2 种预测方法SIFT（https://sift.bii.a-star.edu.sg/）和PROVEN对各个nsSNP 进行有害性预测，分析预测突变后氨基酸的替换是否可能影响的功能。利用在线网站ConSurf进一步对鲁莱黑猪基因编码的氨基酸进行保守位点预测，越保守的位点发生变异越有可能对功能和结构造成影响。

1.5.3 SNaPshot 基因分型 根据SNP 位点搜寻及分析结果，筛选出基因外显子区域内最有可能影响IMF 含量的SNP 位点。将鲁莱黑猪所有的耳组织DNA样品及SNP 位点信息送至上海天昊生物科技有限公司进行SNaPshot 基因分型。

使用PLINK 软件中的线性模型进行关联分析，将性别和体重作为固定效应，其表达式为：y=1+Xb+SNP×+e。其中，y 为测定表型值，表示总体平均值，X 是固定效应的关联矩阵，b 是性别和体重的固定效应向量，为SNP 标记的效应，e 为残差。

2 结果

2.1 鲁莱黑猪表型测定结果 由表2 可知，BW 和IMF在鲁莱黑猪群体中存在较大程度变异，而IMF 的变异程度更高，其变异系数高达65.12%。

表2 鲁莱黑猪群体体重与肌内脂肪的表型统计

2.2功能性突变与鲁莱黑猪BW 和IMF 的关联性分析 经HpyCH4 IV 酶切结果显示，基因位点（XM_013981330.2：g.-1805_-1810del,chr12：55 373 707）PCR 扩增产物产生了等位基因q（143 bp）和Q（91、46 bp），并且检测到了qq、Qq 和QQ 3 种基因型。其中Qq 在群体中为优势基因型，其频率为0.759；Q 为优势等位基因，频率为0.523，具体如表3 和图1 所示。

表3 鲁莱黑猪MYH3基因位点（XM_013981330.2：g.-1805_-1810del,chr12：55 373 707）的基因型频率和基因频率

图1 鲁莱黑猪MYH3基因PCR 产物HpyCH4 IV 酶切检测

功能突变在鲁莱黑猪群体中的关联分析结果显示：该突变在鲁莱黑猪群体中与IMF 无显著关联（表4），表明它可能不是影响鲁莱黑猪IMF 的因果位点，由此需进一步在基因外显子上搜寻是否存在影响着鲁莱黑猪IMF 的突变位点。

表4 MYH3功能性突变在鲁莱黑猪群体中的关联分析

2.3 鲁莱黑猪基因与蛋白质的结构分析 通过测序和序列拼接得到了鲁莱黑猪基因的编码区序列，序列长度为5 790 bp（图2）。BLAST 比对发现鲁莱黑猪基因编码区核苷酸序列与引物源序列的一致性为99.59%。经同源性分析发现，鲁莱黑猪基因编码区核苷酸序列与其他动物如人、倭黑猩猩、绵羊、牛、大鼠、小鼠的一致性分别为86.61%、89.95%、88.13%、87.64%、85.46%、85.27%。鲁莱黑猪基因编码蛋白含有1 929个氨基酸残基。经氨基酸组分分析，鲁莱黑猪基因编码蛋白氨基酸序列含有全部的20 种氨基酸，其中谷氨酸（Glu）含量最高为13.3%，色氨酸（Trp）含量最低，仅有0.5%。正电荷残基（Arg+Lys）总数有313个，负电荷残基（Asp+Glu）总数有359个。氨基酸同源性分析发现，鲁莱黑猪MYH3 蛋白氨基酸序列与人、倭黑猩猩、绵羊、牛、大鼠、小鼠的一致性分别为97.16%、96.86%、96.40%、97.52%、96.75%、96.44%。

图2 鲁莱黑猪MYH3基因核苷酸序列与预测的氨基酸序列

使用在线网站http://web.expasy.org/protparam/和Compute pI/Mw 对鲁莱黑猪MYH3 蛋白理化性质预测，其分子量为222 411.10，理论等电点pI 为5.62。编码产物不稳定指数为46.18，大于40，说明编码产物具有不稳定性。编码蛋白质片段的亲水性平均值为-0.772，表明该基因编码的蛋白质呈现亲水性，由此可推断猪基因编码的蛋白质是一种可溶性蛋白质。NCBI和TMHMM Server v.2.0 在线软件对MYH3 蛋白功能结构域进行分析，结果显示在鲁莱黑猪MYH3 蛋白上未发现跨膜结构，但在1～800 位氨基酸检测到SH1 螺旋结构域、P-loop 结构域、converter 结构域、purinebinding loop、relay loop结构域、switch I 和II结构域以及一个MYSc_Myh3 结构域（100-767）。利用CPHmodels 和Antheprot 3D viewer 在线工具进行鲁莱黑猪MYH3 蛋白质三级结构预测分析，结果如图3 所示。蛋白结构分析显示鲁莱黑猪MYH3 蛋白包含4.9%螺旋、25.7%折叠以及68.4%无规则卷曲结构。

图3 鲁莱黑猪MYH3 蛋白三级结构预测

2.4 鲁莱黑猪基因外显子突变位点搜寻与生物信息学分析

2.4.1 鲁莱黑猪基因外显子PCR 扩增 以DNA混池作为PCR 扩增模板，利用21 对引物进行PCR 扩增，PCR 扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳检测，得到的条带清晰、整齐无拖尾，且扩增片段长度与引物设计时预期长度一致，可用于测序（图4）。

图4 鲁莱黑猪MYH3基因PCR 扩增产物电泳图

2.4.2 SNP 搜寻与预测分析结果 通过对16 头鲁莱黑猪耳组织DNA 样品测序结果进行比对分析，发现在鲁莱黑猪基因外显子区域共发现31个SNP 位点。如表5 所示，有9个SNP 位点属于错义突变（Missense Variant），剩余22个SNP 位点属于同义突变（Synonymous variant）。对1～9 SNP 位点进行有害性预测及保守性分析。结果表明，采用SIFT 和PROVEN 方法分别预测到4个和2个有害突变，其中55351779 和55347097 位置的位点2 种方法均预测为有害位点。利用在线网站ConSurf对位点进行保守性分析，具有高度保守性的位点共有4个，分别是SSC12:55358364、SSC12:55356662、SSC12:55351779 和SSC12:55347097。这4个位点的多态性更容易对蛋白质结构或功能造成影响（表6）。

表5 鲁莱黑猪MYH3基因外显子突变位点氨基酸分析

表6 鲁莱黑猪MYH3基因外显子有害SNP 预测及保守位点预测

2.5 鲁莱黑猪基因外显子突变位点的遗传学分析

2.5.1 鲁莱黑猪基因分型位点的遗传学分析 通过SNP 位点搜寻及分析，统计筛选出4个SNP 位点，分别命名为SNP1、SNP2、SNP3 和SNP4，利用SNaPshot 技术进行基因分型。鲁莱黑猪基因各位点基因分型的计算结果如表7 所示。经卡方检验所有位点均处于Hardy-Weinberg 平衡状态（>0.05）。遗传学分析如表8 所示，在鲁莱黑猪群体中，4个SNP 位点的纯合度均高于杂合度，这表明该4个SNP 位点在鲁莱黑猪群体之中变异程度较小。位点SNP3 多态信息含量（PIC）为0.374，属于中度多态。其余位点多态信息含量（PIC）均小于0.25，属于低度多态。

表7 鲁莱黑猪MYH3基因外显子突变位点基因型频率及基因频率

表8 鲁莱黑猪MYH3基因基因分型位点He、Ho、Ne、PIC参数

2.5.2 鲁莱黑猪基因分型位点与IMF 关联性分析鲁莱黑猪基因分型位点与该群体的IMF 性状、BW 的关联分析结果如表9 所示。鉴于矫正性别分析后，几乎4个SNPs 位点仅与BW 有关联，SNP4 位点与BW显著相关，而SNP1 和SNP2 位点与BW 极显著相关。根据结果发现，筛选的外显子突变位点对鲁莱黑猪IMF性状都没有显著影响，不是影响IMF 的因果突变。

表9 鲁莱黑猪MYH3基因各SNPs与IMF关联分析（P值）

3 讨 论

基因编码胚胎型肌球蛋白重链蛋白，控制肌肉的牵引滑动。它通过分子间的构形改变，从而导致肌球蛋白与ATP 结合，使ATP 水解，继而产生运动强力，进而对于肌肉的生长发育产生明显的影响。近几年来，基因是人类代谢疾病及胎儿发育研究的关注重点，研究发现基因突变可以改变TGF-信号通路和MAPK 信号通路相关蛋白的磷酸化水平，影响肌肉的能量代谢，最终引发肌肉能量代谢疾病。基因在肌肉发育的整个过程中都具有非常重要的作用。王丽君研究发现，基因在肌肉和脂肪中表达量较高，从而验证了该候选基因参与机体的脂质和肌肉的生长、信号传导及肌肉收缩等生理现象。成志敏等研究发现，基因通过影响肌纤维的组成而影响肌纤维特性，初步揭示了造成马身猪和大白猪肌纤维性状差异的主要原因。CHO 等通过染色质免疫共沉淀研究发现，韩国本土黑猪体内基因启动子上存在6 bp 碱基的缺失，使韩国本土黑猪背最长肌的IMF 含量增加。种种研究结果证实基因是IMF 的关键基因。IMF 是个重要的经济性状，其含量直接影响猪肉品质。根据本研究对鲁莱黑猪群体IMF 含量的表型统计发现，该性状在群体中变异程度较大，可能的原因有：第一，鲁莱黑猪的祖代莱芜猪群体中的IMF 表型就存在较大的分离；第二，IMF 属于数量性状，可能受到多个效应的QTL 共同调控，在鲁莱黑猪长期的世代培育过程中积累了足够的重组事件，且不同QTL 组合方式多样，从而造成个体间表型的较大差异；第三，鲁莱黑猪群体在选育过程中可能并未对IMF 进行高强度的选育。由此可见，利用鲁莱黑猪群对IMF 进行QTL 定位及主效基因的鉴别具有较好的优势。

本研究通过测序获得了基因外显子的全序列，通过比对分析发现鲁莱黑猪基因核苷酸序列、编码蛋白的氨基酸序列与其他哺乳动物的同源性均较高，说明基因在不同物种中高度保守。鲁莱黑猪MYH3 蛋白功能结构域分析结果显示MYH3 蛋白未发现跨膜结构，表明该蛋白不具有跨膜功能，含有SH1 螺旋结构域、P-loop 结构以及MYSc_Myh3 结构域。SH1 螺旋结构域含有约100个氨基酸，结构域与氨基酸组成了保守特性，与前面测序结果比对相一致。P-loop 结构域中的Glu148 和Tyr150 易发生突变降低蛋白酶的活性，且该区域广泛存在于磷酸结合蛋白中，磷酸化位点对基因具有重要功能。而MYSc_Myh3 结构域具有编码驱动蛋白以及调控蛋白的作用，由此可以推测MYH3 蛋白可能具有调控的作用。

2019 年发表在《PLOS Genetic》的论文结果表明：位于基因启动子区的功能性突变是影响韩国本土黑猪肌内脂肪含量的因果突变，且最后文章结果表明该位点在中国地方猪中存在分离，但并无与表型关联分析结果，因此本文根据CHO 等的研究结果设计实验思路，在肌内脂肪含量表型分离显著、具有代表性的中国培育品种——鲁莱黑猪群体中开展该位点的基因型检测与关联分析工作。首先通过酶切实验及测序在鲁莱黑猪群体中对位点（XM_013981330.2：g.-1805_-1810del,chr12：55 373 707）进行检测，结果在群体中发现了该位点的等位基因Q，多态性分析结果显示该位点的野生型基因q 频率为0.477，突变型基因Q 频率为0.523。根据先前研究结果发现，在西方商品猪中如长白猪、大白猪中几乎检测不到Q 基因的存在或者频率很低。经关联分析检测结果表明，基因启动子区6 bp 碱基的缺失不是影响鲁莱黑猪IMF 的因果突变，这可能是由于鲁莱黑猪与韩国本土猪的血缘品种不同或者生存环境的差异造成的。所以推测在基因上可能存在别的位点影响其IMF 含量。同时表明：有必要在其他中国地方猪群体中检测该突变对表型的效应，为猪肉质性状的分子标记辅助育种提供重要理论依据。从基因外显子中所有的SNPs 位点分析，经过有害性预测及位点保守性分析筛选出4个SNPs 位点，对其进行多态性检测以及与IMF 等性状的关联分析，结果显示大多数位点仅与体重有关，提示上述位点可以作为鲁莱黑猪体重指标育种的潜在分子标记，而不能作为IMF 指标育种的分子标记位点。此外，可以推测鲁莱黑猪群体中存在新的突变位点/主效基因影响着IMF 的含量，为后期鉴定真正的因果突变奠定了基础。

4 结 论

本研究结果显示，基因启动子区中功能性突变位点（XM_013981330.2：g.-1805_-1810del,chr12：55 373 707）可能不是影响鲁莱黑猪IMF 的因果位点，而检测的4个基因外显子突变位点与肌内脂肪不存在显著关联。因此，在鲁莱黑猪群体中可能存在其他的突变位点/主效基因影响其IMF。