乳酸菌和纤维素酶对马铃薯渣与玉米秸秆混合青贮发酵品质、有氧稳定性和体外发酵参数的影响

王啸林，冯冠智，张城瑞，房新鹏，张广宁，张永根

（东北农业大学动物科学技术学院，黑龙江哈尔滨 150030）

马铃薯渣作为马铃薯淀粉生产过程中的主要副产物，其营养物质种类较多、含量丰富。但由于马铃薯渣具有水分含量高和适口性差等特点，保存时易腐败变质。我国农作物玉米秸秆产量较高，资源丰富，将玉米秸秆与马铃薯渣混合青贮可吸收后者含量较高的水分，但由于玉米秸秆木质素含量较高，粗蛋白质和矿物质含量较低；并且二者自身的乳酸菌附着量较少，活性较低，因此在混贮发酵饲料的品质难以得到保证。乳酸菌（LAB）、纤维素酶（EN）是青贮过程中的常用添加剂。LAB 能有效改善青贮饲料的发酵品质和纤维消化率，使总氮比值、挥发性脂肪酸（VFA）和甲烷产量以及中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的浓度下降。此外，有研究表明，将植物乳杆菌与布氏乳杆菌合用可提高全株玉米青贮的有氧稳定性。添加EN 可促进青贮原料中的结构性碳水化合物降解为LAB 能够利用的水溶性碳水化合物，提供充足的发酵底物，使青贮饲料的营养品质得到改善。EN 还可以降低青贮饲料pH 和中性洗涤纤维含量，改善青贮饲料的饲用价值。因此，本试验拟将LAB 和EN 添加到不同比例马铃薯渣玉米秸秆混合青贮饲料中，探究其对混合青贮发酵品质、有氧稳定性和体外发酵参数的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料 马铃薯渣取自黑龙江省九三农场；玉米秸秆取自东北农业大学阿城实验基地；LAB 添加剂的主要成分为植物乳杆菌（，活菌数为1×10CFU/g，中国普通微生物菌种保藏管理中心）和布氏乳杆菌（，活菌数为1×10CFU/g，北京北纳创联生物技术研究院）的比例为1:1；EN 活性为10 000 U/g（沧州夏盛酶生物技术有限公司）。

1.2 试验设计 采用双因素（原料配比×添加剂）试验设计，设置混合青贮中马铃薯渣和玉米秸秆（切割揉碎至1～2 cm）的鲜重（FM）质量比分别为6:4（PC组）和8:2（PC组），2 种混合比例的青贮饲料的营养成分如表1 所示。每种青贮充分混匀后分为处理组和对照组，处理组分别添加LAB 1×10CFU/g、EN 100 U/g、LAB 1×10CFU/g+EN 100 U/g，对照组则不添加LAB 和EN。将经过处理的各组混合料装入聚乙烯青贮袋，24袋（4 处理×2 比例×3 重复）用于测定营养指标、发酵指标和体外参数；另取72 袋（4 处理×2 比例×3 好氧暴露天数×3 重复）用于评定有氧稳定性。压实后用真空包装机抽真空密封，在室温条件下青贮。30 d 后开封取样，测定各种指标含量。

表1 马铃薯渣和玉米秸秆混贮前的营养成分

1.3 营养指标的测定 按照AOAC的方法分析测定DM 和CP 含量；根据van Soest 等的方法测定NDF、ADF 以及ADL 含量；采用硫酸-蒽酮法测定WSC含量。通过公式计算得出CE 和HE 含量：HE=NDFADF，CE=ADF－ADL。

1.4 发酵指标的测定 pH 采用Sartorius PB-10 型酸度计（赛多利斯科学仪器北京有限公司） 测定；乳酸（LA）含量按照卢定强等的方法采用Waters-600 高效液相色谱仪测定；乙酸（AA）和丙酸（PA）含量采用气相色谱法（岛津GC-2010）测定；氨氮浓度（AN）采用靛酚蓝法测定。微生物数量测定方法：取样品10 g，加入90 mL 生理盐水后放入摇床摇匀，取混匀后的菌液逐步稀释，将稀释后的菌液均匀涂布在MRS 琼脂培养基的平板上，37℃恒温培养48 h 后计数乳酸菌；均匀涂布在马铃薯葡萄糖琼脂培养基的平板上，30℃恒温培养48～72 h 后计数酵母菌和霉菌。

1.5 有氧稳定性的评定 青贮30 d 后，各组取出9 袋进行有氧稳定性试验。将每袋混合青贮料取出，充分混合，松散装入10 L 塑料容器中，不压实。容器在环境温度（20～25℃）下储存，用双层粗棉布覆盖以避免污染并保证青贮料的干燥，同时促进空气渗入青贮料团块。分别于有氧暴露后第3、5、7 天各取3 袋，进行pH 和微生物数量的测定。

1.6 体外发酵参数的测定 选择3 头装有永久性瘤胃瘘管的健康荷斯坦奶牛为瘤胃液供体，于晨饲前通过瘘管采集瘤胃液并混匀，经4 层纱布滤入提前装有39℃热水并通入CO的保温瓶中，密封瓶口并带回实验室，将瘤胃液与事先配置好的人工唾液（由微量元素溶液、缓冲溶液、常量元素溶液、0.1% 刃天青溶液和还原剂溶液组成）混合均匀。将称量准确的0.500 0 g 样品用纤维袋封好，放入培养管中，排净气体，并立即转入事先预热的39℃人工瘤胃培养箱中发酵48 h。参考汤少勋等的方法测定并计算累计总产气量（GP48）。将发酵液分装出3 份，分别用于测定VFA 含量、氨态氮（NH-N）含量以及微生物蛋白（MCP）浓度，其中MCP 浓度根据苏海涯的方法测定。管内剩余发酵液用于测定pH。此外，从培养管里取出装有样品的纤维袋，通过培养前后样品失重计算体外干物质消失率。

1.7 统计分析 采用SAS 的GLM 程序，在处理（LAB和EN）、原料比例和处理×原料比例的影响下，采用双因素方差分析对营养品质、发酵品质和体外发酵参数进行研究；在处理（LAB 和EN）、有氧暴露天数和处理×有氧暴露天数的影响下，采用双因素方差分析对有氧稳定性进行研究。多重比较采用Duncan's 法检验，<0.05 为显著性差异。

2 结果

2.1 混合比例和添加剂对混合青贮饲料营养品质的影响由表2 可见，在使用添加剂相同的条件下，PC组中DM、NDF、ADF 以及CE 含量高于PC组（<0.05），而CP 含量则低于PC组（<0.05）。在混合比例相同的条件下，PC组中，各添加剂处理组DM 含量低于对照组（<0.05）；LAB 组和LAB+EN 组ADF 含量低于对照组（<0.05）；与对照组相比，EN 组和LAB+EN组CP 含量分别提高15%和13%（<0.05）；各添加剂处理组的WSC 含量较对照组分别提高了26%、27%和48%（<0.05）。在PC组中，与对照组相比，EN 组和LAB+EN 组ADF 含量均降低（<0.05），而WSC含量增加（<0.05）；LAB+EN 组NDF 含量低于对照组（<0.05）。

表2 混合比例与添加剂对混合青贮饲料营养品质的影响

2.2 混合比例和添加剂对混合青贮饲料发酵品质的影响 由表3 可见，在使用添加剂相同的条件下，PC组pH 高于PC组（<0.05），但两组内所有处理的青贮料pH 都低于4.2，均符合优良青贮的要求；PC组LA含量和乳酸菌数量高于PC组（<0.05），而AA、PA和AN 含量均低于PC组（<0.05）。在混合比例相同的条件下，在PC组和PC组中，LAB+EN 组pH 低于其他3 组（<0.05），而AN 含量低于对照组和EN 组（<0.05）。此外，PC组中，与对照组相比，LAB 组和LAB+EN 组LA 含量和乳酸菌数量增加（<0.05），AA 含量则降低（<0.05）。

表3 混合比例与添加剂对混合青贮饲料发酵品质的影响

2.3 混合比例和添加剂对混合青贮饲料有氧稳定性的影响 由表4 和表5 可见，在使用添加剂相同的条件下，随着有氧暴露天数的增长，各处理组的pH 升高（<0.05），乳酸菌数量减少（<0.05），酵母菌和霉菌数量增加（<0.05）。在混合比例相同的条件下，随着有氧暴露的进行，LAB 组和LAB+EN 组乳酸菌数量高于其他2 组（<0.05），酵母菌和霉菌数量低于其他两组（<0.05）。PC组中，LAB 组和LAB+EN 组pH始终低于4.20，且LAB+EN 组pH 最低；对照组和EN组pH 在有氧暴露的第7 天分别升高到5.00 和4.63。在PC组中，LAB 组和LAB+EN 组pH 始终低于4.30，且LAB+EN 组pH 最低；对照组和EN 组pH 在有氧暴露的第7 天分别升高到5.11 和4.58。

表4 不同处理对PC1 组混合青贮饲料7 d 有氧条件下发酵品质的影响

表5 不同处理对PC2 组混合青贮饲料7 d 有氧条件下发酵品质的影响

2.4 混合比例和添加剂对混合青贮饲料体外发酵参数的影响 由表6 可见，在使用添加剂相同的条件下，PC组的体外干物质消失率低于PC组（<0.05）。在混合比例相同的条件下，PC组中，LAB+EN 组发酵液TVFA、乙酸和丙酸含量高于对照组（<0.05）；EN 组和LAB+EN 组体外干物质消失率较对照组分别升高了7% 和18%（<0.05）。在PC组中，EN 组和LAB+EN 组的发酵液TVFA、乙酸和丙酸含量、体外干物质消失率以及累计产气量均高于对照组（<0.05）。

表6 混合比例与添加剂对混合青贮饲料体外发酵参数的影响

3 讨 论

3.1 混合比例和添加剂对混合青贮饲料营养品质的影响饲料的营养品质能通过比较其化学成分进行评价，其中NDF、ADF 和CP 含量是主要评价指标，NDF 和ADF含量越低，CP 含量越高，饲料品质越好。张朝阳等研究结果表明，降低草木犀和玉米秸秆混合青贮中玉米秸秆的比例可以提高CP 含量，并降低NDF 和ADF 含量。本研究结果也表明，与PC组相比，PC组有较高的CP 含量以及较低的NDF 和ADF 含量，说明PC组的青贮饲料营养价值更高，这可能是由于玉米秸秆本身纤维含量较高，CP 含量较低，而PC组中玉米秸秆所占比例较低造成的。Zhang 等研究结果表明，LAB和EN 处理的湿玉米蛋白饲料和玉米秸秆全混合日粮中NDF 和ADF 含量降低，WSC 含量升高。本研究的结果也表明，LAB+EN 组的青贮饲料NDF 和ADF 含量较低，而WSC 含量较高。这可能是由于在青贮过程中，EN 可将青贮饲料细胞壁中的木质纤维成分降解为水溶性碳水化合物，为乳酸菌发酵提供更多的底物，而添加LAB 则可以保留更多的营养物质。此外，由于发酵底物的增加，早期乳酸发酵取得优势，导致pH 降低，从而抑制不良微生物的新陈代谢，也减少了某些能够分解蛋白质并产生胺类化合物的厌氧微生物（如梭菌），改善了青贮饲料的营养品质。王兴刚在稻草秸秆中添加LAB 和EN 较好地保存了CP 等营养成分。本试验中LAB+EN 组CP 含量亦较高。

3.2 混合比例和添加剂对混合青贮饲料发酵品质的影响青贮饲料的发酵品质主要是通过pH、AN 以及有机酸含量等指标来反映，当pH 与AN 含量低、有机酸含量多时，青贮饲料不仅可以较好保存，而且具有更高的品质。在青贮期间，由乳酸菌产生的乳酸通常情况下是含量最高的酸，对于早期抑制不良微生物的生长以及减少营养物质的损失有着重要意义。优质的青贮饲料应该具有大量的乳酸、较少的乙酸和丙酸及AN 含量、pH 较低等特点。与PC组相比，PC组青贮的乳酸含量较高，因此pH 更低。这可能是由于玉米秸秆的增多能为乳酸菌发酵提供能量，产生更多的乳酸，使pH 迅速下降，同时抑制了乙酸和丙酸的生成。谭树义等将复合酶制剂（主要成分是纤维素酶和木聚糖酶）和LAB 添加于玉米秸秆，增加乳酸含量的同时降低了pH和AN 浓度。本研究结果也表明，LAB+EN 处理的青贮饲料乳酸菌数量及乳酸含量增加，AN 浓度和pH 降低。这可能是由于LAB 与EN 之间存在协同作用，EN 能够解开纤维素链间和链内的氢键，形成无序的非结晶纤维素，随后玉米秸秆中的纤维成分被迅速降解为单糖或双糖，促进了LAB 的繁殖，而添加LAB 带来更多的底物，会大量发酵生成乳酸，导致pH 的迅速下降，改善青贮饲料的品质。除此之外，Sheperd 等研究结果表明，添加纤维素酶对青贮玉米的挥发性脂肪酸以及AN 浓度均无影响。本研究结果也表明，与对照组相比，EN 组pH、乳酸和乙酸的含量以及AN 浓度差异并不显著。这可能是由于原料自身的发酵底物足够充分，所以添加EN 对于发酵品质的影响不大。

3.3 混合比例和添加剂对混合青贮饲料有氧稳定性的影响 开窖后的青贮饲料与氧气充分接触，导致酵母菌、霉菌以及梭菌等好氧微生物活动性增强，这些好氧细菌的增殖会引起温度和pH 的异常升高，造成营养物质的损失以及青贮饲料的腐败变质。而青贮饲料的有氧稳定性是指，与氧气接触后饲料的pH 和温度均不升高，仍旧保持新鲜、气味酸香的能力。通常情况下，抑制酵母菌的快速增殖以及降低青贮pH 对提高饲料的有氧稳定性具有重要意义。Zhang 等研究结果表明，在湿玉米蛋白饲料和玉米秸秆全混合日粮中添加LAB和EN 后可降低pH、酵母菌以及霉菌数量。本研究的结果也表明，LAB 组和LAB+EN 组的混合青贮在好氧暴露后，酵母菌数量以及pH 显著低于其他两组。这是由于本试验所选用的乳酸菌制剂为复合乳酸菌，主要成分为植物乳杆菌和布氏乳杆菌，其中植物乳杆菌能提高青贮饲料中的乳酸含量，促进饲料pH 的降低，使蛋白质的损失率减少，同时抑制丁酸等有害物质的发酵，其青贮品质得到改善；而布氏乳杆菌属于异型发酵乳酸菌，除了生成乳酸之外，还可以产生较多的挥发性短链脂肪酸（如乙酸），对降低青贮发酵后期pH 有重要作用，进而抑制霉菌、酵母菌等好氧微生物的生长。

3.4 混合比例和添加剂对混合青贮饲料体外发酵参数的影响 瘤胃液pH 在一定程度上反映了瘤胃消化代谢状况，与微生物的活动与繁殖息息相关，是评价瘤胃功能和生理状况的重要指标。通常情况下，瘤胃液pH 的正常范围是6.2～6.8。在本试验中，体外发酵液的pH 在6.45～6.63，均在正常范围内。体外干物质消失率可以反映体外发酵时底物的降解效果，其中CP 容易被降解，而NDF 则难以被利用。本试验中，PC组的体外干物质消失率低于PC组，这是由于PC组中玉米秸秆的比例较高，导致其纤维含量较高，CP 含量较低，而NDF 的大量存在导致饲料不容易被降解，因此PC组饲料底物的降解效果变差。饲料体外发酵产气的原料主要是非结构性碳水化合物，因此累计产气量可以反映饲料的发酵程度，进而评价瘤胃发酵粗饲料的利用率。万江春等研究结果表明，纤维素酶和乳酸菌（主要成分是植物乳杆菌和干酪乳杆菌）同时应用于棉花秸秆青贮中提高了产气量。本研究的结果也表明，LAB+EN处理使青贮饲料的累计产气量升高。这可能是由于EN能够降解植物细胞壁中的纤维成分，本身难以利用的中性洗涤纤维在EN 的作用下迅速被降解并利用，提高了饲料利用率；在此基础上添加LAB 可以促进乳酸的生成，减少饲料中CP 等营养物质的损失。

4 结 论

在本研究条件下，混合青贮原料马铃薯渣与玉米秸秆的比例为8:2（PC）时具有较好的营养品质和体外消化率，而混合比例为6:4（PC）时具有较好的发酵品质；在此基础上，联合添加LAB 和EN 能使混合青贮具有更好的营养品质、发酵品质、有氧稳定性和体外消化率。