三种中药提取物的体外抑菌及稳定性研究

王丽娜，冯紫艳

(许昌学院 食品与药学院，河南 许昌 461000)

黄芩，又叫山茶根，是唇形科黄芩属多年生草本根植物，具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗病毒等药理作用[1].黄芩苷、黄芩素是从黄芩根部提取出来的一种黄酮类化合物，是黄芩发挥药效的关键成分[2].秦皮为木樨科植物苦枥白蜡树、白蜡树、尖叶白蜡树、宿柱白蜡树的干燥枝皮.秦皮甲素为中药秦皮的有效成分之一，具有抗炎作用[3].为了考查三种中药提取物的体外抑菌及稳定性，通过研究黄芩苷、黄芩素和秦皮甲素对革兰氏阴性菌大肠杆菌和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌的体外抑菌试验，分析温度和pH对其抑菌稳定性的影响，为联合用药研究打下理论基础.

1 材料与仪器

1.1 药品和材料

黄芩苷：植物提取物有限公司；黄芩素：由南京源植生物科技有限公司；秦皮甲素：南京源植生物科技有限公司；LB琼脂平板：北京奥博星生物技术有限公司；无水乙醇：分析纯，无锡市亚泰联合化工有限公司；二甲基亚砜(DMSO)：天津科密欧；滤纸；打孔器；培养皿；涂布棒等.

1.2 菌种

金黄色葡萄球菌、大肠杆菌由实验室提供.

1.3 仪器

MJ-54A高压蒸汽灭菌锅，师都凯仪仪器设备有限公司；SW-CJ-2FD超净工作台，苏州净化设备工程有限公司；SHP生化培养箱，北京中兴伟业仪器有限公司.

2 试验方法

2.1 药液的制备

2.1.1 黄芩苷药液的制备

称取黄芩苷4.0 g，加入50 mL容量瓶中用无菌水定容，制成80 mg·mL-1的母液备用.

2.1.2 黄芩素药液的制备

称取4.0 g黄芩素，加入50 mL容量瓶中用60%乙醇定容，制成80 mg·mL-1的母液备用.

2.1.3 秦皮甲素药液的制备

准确称取4.0 g秦皮甲素，加入50 mL容量瓶中，用二甲基亚砜定容，制成80 mg·mL-1的母液备用.

[44]Dong Huk Park, et al., “Attentive Explanations: Justifying Decisions and Pointing to the Evidence”, https://arxiv.org/pdf/1612.04757v1.pdf.

2.2 菌悬液的制备

挑选用斜面培养16 h左右正处于对数生长期的菌体，放入有玻璃球的无菌生理盐水中，充分混匀，用倾注平板法测定菌落总数，使其浓度在104～106CF6U/mL，备用[4].

2.3 药敏片的制备及抑菌活性的测定

取定性滤纸，用打孔器打成6 mm直径的圆形小纸片，将滤纸片放入培养皿中，经高压灭菌后放入干燥器，干燥后备用.制备LB平板，做标记.分别取金黄色葡萄球菌、大肠杆菌两种待测菌悬液100 μL，接种于相应培养基平板上，涂布棒涂布均匀后即制备好带菌平板.将制备好的无菌滤纸片(6 mm)分散平放在平板上，再在滤纸片上分别滴加10 μL由2.1制备的药液的母液，以药液的相应溶剂作空白对照.在37 ℃恒温培养箱中培养24 h后，使用游标卡尺并采用十字交叉法测量抑菌圈直径.每组试验各做三个平行，取其平均值[5].

2.4 最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的测定

采用二倍稀释法将三种药液进行稀释，制成40，20，10，5，2.5，1.25 mg·mL-1等不同浓度的药液.制备LB平板并进行编号.各取100 μL两种供试菌菌悬液分别滴加在相应编号的LB平板上并涂布均匀，在平板上分散放置无菌滤纸片，滴加不同浓度的药液10 μL，在37 ℃的恒温培养箱中培养24 h.采用交叉法测量不同浓度药物的抑菌圈直径，确定最小抑菌浓度.确定MIC后将平板继续培养24 h，再次测定抑菌圈直径，确定相应物质的最低杀菌浓度.

2.5 抑菌稳定性研究

2.5.1 温度对3种中药提取物稳定性的影响

将40 mg·mL-1的药液分别置于20，40，60，80，100 ℃的水浴锅中保温15 min，然后在121 ℃的高压灭菌锅中保持15 min，自然冷却至室温备用[6].

在已经做好标记的LB平板上分别滴加对应的供试菌菌悬液100 μL，用涂布棒涂布均匀后，将灭菌过的滤纸片分散平放在带菌平板表面，在每个滤纸片上分别滴加10 μL药液，这些药液分别经过20，40，60，80，100，121 ℃热处理过，未经高温处理过的药液作为对照组.在37 ℃的恒温培养箱中倒置，培养24 h后测量抑菌圈直径.每组试验各做三个平行样，取其平均值.比较不同温度对各种药物抑菌活性的影响.

2.5.2 pH对3种中药提取物稳定性的影响

分别用0.1 mol·L-1的HCl和0.1 mol·L-1NaOH溶液调节培养基的pH，灭菌后的培养基制成pH分别为4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0的LB平板.用滤纸片法检测不同pH的环境对三种药物抑菌性的影响，每种药物做三个平行样，取其平均值[7].

3 试验结果

3.1 抑菌活性的测定结果

表1 80 mg·mL-1的黄芩苷、黄芩素、秦皮甲素的抑菌圈直径/mm

3.2 最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的测定

根据2.4进行试验，最小抑菌浓度(MIC)试验结果见表2、表3、表4.可以看出，黄芩苷、黄芩素、秦皮甲素对大肠杆菌的最小抑菌浓度分别为40，2.5，20 mg·mL-1；对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度则分别为5，2.5，10 mg·mL-1.确定MIC后将平板继续培养24 h，再次测定抑菌圈直径，确定黄芩苷、黄芩素、秦皮甲素对大肠杆菌的最小杀菌浓度分别为40，5，20 mg·mL-1；对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度则分别为5，5，20 mg·mL-1.

表2 黄芩苷药液的抑菌结果(MIC)

表3 黄芩素药液的抑菌结果(MIC)

表4 秦皮甲素药液的抑菌结果(MIC)

3.3 温度对3种中药提取物稳定性的影响的结果

根据2.5.1进行试验，实验结果如图1所示.可以看出，黄芩苷对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌作用与20 ℃下的抑菌结果相近，温度对黄芩苷的影响较小.黄芩素对大肠杆菌的抑菌作用在40～80 ℃的抑菌效果与20 ℃差别不大；温度在100 ℃时抑菌效果略有下降，温度为121 ℃时则下降明显.秦皮甲素对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在40、60、80 ℃的抑菌效果与20 ℃相比有所提升，在100 ℃和121 ℃的抑菌效果有所下降，但变化不明显.

图1 温度对三种中药提取物抑菌稳定性的影响

3.4 pH值对3种中药提取物稳定性影响的结果

根据2.5.2进行试验，不同pH值对3种药物提取物抑菌活性的影响结果如图2所示.可以看出，随着介质的pH值升高，黄芩苷无论是对金黄色葡萄球菌还是对大肠杆菌抑制能力都是在酸性环境下较好，而且随着pH值增高，抑菌活性明显下降.这与QIU F等[8]的研究，结果一致，这可能是碱性环境下破坏了黄芩苷的活性物质.黄芩素对两种菌的最适的抑菌pH值均为6，偏酸时抑菌影响不显著，偏碱性环境，特别是pH值为10是影响较为明显.秦皮甲素最好的抑菌pH值为偏碱性,pH值在8～9时的抑菌效果较好，原因可能是酸性和强碱性环境会影响秦皮甲素的活性.

4 结语

试验结果表明对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌效果最好的均为黄芩素.黄芩苷热稳定性较好，在121 ℃以下比较稳定;黄芩素和秦皮甲对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果受温度影响较大.黄芩苷和黄芩素在偏酸性环境中抑菌活性较好，秦皮甲素在偏碱性环境中抑菌效果较好.

只是对三种药物的抑菌情况及其稳定性进行实验，将来要对其稳定性变化的原因加以研究.另外，这仅仅是单一药物试验，以后要进一步进行联合用药试验.

图2 pH对三种中药提取物抑菌稳定性的影响