不同代数骨髓源性巨噬细胞增殖及诱导破骨分化的规律研究

陈弘林 沈耿杨 尚奇 秦威城 余富勇 招文华 张志达 张鹏 唐福宇 江晓兵 任辉*

1.广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405 2.广州中医药大学，广东 广州 510006 3.广州中医药大学岭南医学研究中心，广东 广州 510405 4.柳州市中医医院，广西 柳州 545001

破骨细胞是一种组织特异性的巨噬细胞多核体，由骨表面或骨表面附近的单核/巨噬细胞前体细胞分化而成[1]。成熟的破骨细胞粘附于骨基质，分泌酸和溶解酶，降解骨基质[2]。在生命中，骨骼是一个坚硬但充满活力的器官，它不断地被塑造和修复。骨一旦形成，就会经历一个称为重塑的过程，包括骨的分解(吸收)和形成(合成)。骨重塑是成人生活中调节骨结构和功能的主要代谢过程，破骨细胞是关键参与者。重塑的不平衡会导致骨骼结构和功能的严重损害[3-4]。因此，掌握巨噬细胞诱导破骨分化这一过程，就可以控制骨重塑的平衡。

然而，破骨细胞作为一种终末分化细胞，其无法传代培养、存活时间短、体内数量少等特性使得它的培养效率低下。这一难题极大地限制了骨稳态领域的研究，因此，一种理想良好的破骨细胞诱导方法对骨重塑的研究意义重大。目前破骨细胞的培养方案大多采用骨髓源性巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages，BMDM)进行诱导，但是细胞杂质多，增殖速度慢，诱导成功率不高等问题[5]。同时，培养过程中对于BMDM诱导破骨分化的代数要求并未明确提及，以及是否存在一定的规律性也未了解。所以，为了便于更好培养破骨细胞进行研究，本研究通过比较BMDM不同代数之间的增殖及破骨分化情况，研究其中存在的规律，为接下来科研人员开展破骨细胞相关研究提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1实验动物选取8周龄C57BL/6小鼠，体质量20～25 g，由广州中医药大学实验动物中心提供，动物实验经广州中医药大学第一附属医院伦理委员会批准(编号：TCMF1-2019030)。

1.1.2试剂与耗材α-MEM培养基(GIBCO)；胎牛血清(GIBCO)；Recombinant Mouse TRANCE/TNFSF11/RANK L (462-TEC-010，RD)；Recombinant Mouse M-CSF Protein(416-ML-010，RD)；红细胞裂解液(Beyotime)；CCK-8 试剂盒(日本同仁)；抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)染色试剂盒(Sigma)。70 μm细胞筛(FALCON)；75 cm2培养瓶(CORNING)，培养皿(CORNING)，96孔板(CORNING)。

1.2 方法

1.2.1小鼠BMDM的提取与培养：8周龄C57BL/6雄性小鼠经颈椎脱臼法处死后，75 %酒精浸泡5 min后，无菌操作完整分离小鼠双下肢，快速剥离软组织，取出股骨与胫骨，剪去长骨两端，用PBS从两端交替冲洗骨髓腔，冲洗液经70 μm细胞筛过滤后离心(1 500 r/min，5 min)，弃上清；加入适量体积的红细胞裂解液吹打重悬，于冰上静置裂解5 min，离心，弃上清；再次PBS重悬，离心，弃上清；得到的细胞沉淀用α-MEM培养基(含10 % 胎牛血清，25 ng/mL MCSF)重悬，接种至75 cm2培养瓶，置于二氧化碳培养箱(37 ℃，5 % CO2)培养，细胞培养基每两天更换一次[6]。

1.2.2BMDM传代和分组：BMDM细胞贴壁后为梭形，簇状分布，长满瓶底80 %时，使用胰酶消化后传代，加入含有25 ng/mL M-CSF的完全培养基置于二氧化碳培养箱(37 ℃，5 % CO2)培养，细胞培养基每两天更换一次。根据传代次数，研究分组为P0组、P1组、P2组、P3组及P4组，倒置显微镜镜下进行观察并拍照。

1.2.3CCK8检测细胞增殖活性：P0组、P1组、P2组、P3组及P4组细胞以2×103个/孔的密度接种于96 孔板中，每组6个复孔，待细胞贴壁，在含有25 ng/mL M-CSF的完全培养基培养0 h、24 h、48 h、72 h及96 h后运用CCK-8 法检测BMDM细胞的增殖能力。根据CCK-8试剂盒说明书进行操作，使用酶标仪测定BMDM经450 nm 波长处的光密度值(optical density，OD)[7]，生物重复3次。

1.2.4体外破骨细胞培养：P0～P4代BMDM以2×103个/孔密度传代于96孔培养板中培养，置于二氧化碳培养箱(37 ℃，5 % CO2)培养5～7 d，加入25 ng/mL M-CSF和50 ng/mL RANKL，每两天换液一次。

1.2.5TRAP染色检测破骨分化：BMDM用上述方法诱导后，镜下观察到明显的多核融合的破骨细胞时行TRAP染色，弃原培养基，使用PBS 洗3遍，每次5 min，加入4 %多聚甲醛进行固定30 min，再次PBS洗3遍，每次5 min，洗时注意轻柔操作。最后加入TRAP 染色工作液，避光37 ℃孵育1 h，PBS 洗2遍，可见孔内细胞表面被染成酒红色，孔板风干后在倒置显微镜下观察并拍照。TRAP阳性细胞有3个或3个以上的核，即认为是成熟的破骨细胞。使用Image J软件量化破骨细胞的数量和面积。生物重复3次。

1.3 统计学处理

采用SPSS 22.0 统计软件对数据进行统计学分析，所有数据均以均数±标准差表示。所有样本均符合正态分布，并验证了方差齐性。两个独立样本的比较采用两独立样本t检验。采用单因素方差分析(One-way ANOVA)对多组单因素样本进行比较。采用双因素方差分析(Two-way ANOVA)比较双变量多样本组。当P< 0.05时，认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 P0～P4代BMDM的形态学差异

从小鼠骨髓分离的BMDM经M-CSF培养后，对不同代数的BMDM进行倒置显微镜下拍照。结果显示，P0代见多种细胞并存，成纤维细胞或其他杂质细胞较多；其中可见BMDM贴壁，细胞透亮，呈小圆形或椭圆形，细胞膜边界完整清晰，形态有一定的规整性。P1代可见杂质细胞减少，能明显观察到部分BMDM呈椭圆形伴一端或两端有触角伸出。P2代见BMDM两端触角较P1明显伸长，细胞整体呈梭形，细胞大小基本一致，形态均一，密度较高，且呈典型集落分布，基本无杂质细胞。P3代可见BMDM呈长梭形，集落分布，少量BMDM有多个伪足伸出。P4代见细胞狭长，多个BMDM伪足增多，较P3代伪足明显变长(见图1)。

注：骨髓源性巨噬细胞不同代数镜下拍照，黄色箭头为成纤维细胞或其他杂质细胞，绿色箭头为衰老的BMDM。采用单因素方差分析(One-way ANOVA)对多组单因素样本进行比较。图1 P0～P4代BMDM的形态学差异Fig.1 Morphological differences of P0-P4 generation BMDMs

2.2 P0～P4代BMDM增殖能力差异

通过比较CCK8实验中P0～P4代BMDM在0、24、48、72 h及96 h5个不同时间点在450 nm 波长处的OD值，从而对比P0～P4代BMDM间的增殖活性差异。结果显示，在0、24 h和48h3个时间点上，P0～P4代BMDM间的增殖能力部分存在差异；在72 h和96 h这两个时间点上，P2组BMDM的增殖能力显著高于其他组(P< 0.000 1，图2 A)。可见细胞培养24 h时P2组BMDM的增殖能力高于P4组(P< 0.001，图2 A)；48 h 时P1～P4组BMDM的增殖能力均显著高于P0组(P< 0.000 1，图2 A)，P3组BMDM的增殖能力高于P4组(P< 0.05，图2 A)。依据OD值，绘制细胞在不同时间点的增殖曲线(图2 B)，可直观的发现0、24、48、72、96 h内，P2组BMDM增殖能力最强，P3组次之，P0组、P1组最差，见图2。

注：采用双因素方差分析(Two-way ANOVA)比较双变量多样本组；*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001，****P< 0.0001。图2 P0～P4代BMDM增殖能力差异Fig.2 Differences in the proliferation ability of BMDMs of P0-P4 generations

2.3 P0～P4代BMDM诱导破骨分化形态差异

P0-P4代BMDM通过M-CSF和RANKL诱导破骨分化，培养5～7 d后进行TRAP染色比较P0～P4间诱导破骨分化的形态不同。结果显示，P0～P4代的破骨细胞数量和面积呈先增后减的趋势，其中P2代BMDM诱导破骨分化获得成熟的破骨细胞数量最多、面积最大；P3组次之；P0组、P1组、P4组诱导出破骨细胞数量少，面积小。见图3。

注：两个独立样本的比较采用两独立样本t检验。图3 P0-P4代BMDM诱导破骨分化潜能差异Fig.3 Differences in the osteoclast differentiation potential of P0-P4 generation BMDM

3 讨论

你走的每一步都会对你的骨骼造成微小的损伤，因此你的骨骼必须不断重塑以保持其强度。这种重塑涉及到骨的破坏和形成，这两个过程紧密耦合，并由信号分子(如激素)控制[8-9]。缺乏这些分子中的一种就会导致骨骼迅速破裂，就像绝经后女性体内雌激素丢失时所发生的那样，由此产生的骨质疏松症每年都会造成数百万例骨折。目前的骨质疏松治疗不能将骨降解和骨形成分离开来，它们同时刺激或抑制这两个过程，尽管强度不同。在骨折愈合的过程中，成骨细胞合成骨基质以固定骨碎片，而破骨细胞在骨折后不久吸收小的骨碎片，在愈合的后期吸收未成熟的骨基质[10-12]。破骨分化作为骨稳态相关疾病治疗的关键调控点，有助于阐明骨微环境中骨形成的机制。

破骨细胞诱导生成实验是在体外分离和培养破骨细胞的最广泛的方法。M-CSF和RANKL不仅是体外诱导巨噬细胞完成破骨分化的必要因子，而且这两种因子的浓度极大地影响了破骨细胞在体外培养的效率，包括巨噬细胞的增殖，破骨细胞的个数、面积和骨吸收能力。目前体外培养主要通过诱导RAW 264.7细胞或BMDM获得破骨细胞。RAW 264.7突破破骨细胞前体存活时间短的限制，只需要低浓度的RANKL刺激因子就可以完成诱导稳定获取破骨细胞[13-15]，从而受到相当数量研究者的青睐。相比较而言，BMDM诱导法操作过程复杂，需要MCSF和RANKL同时刺激才能诱导破骨分化，其形成的破骨细胞数量少于RAW264.7细胞诱导法，BMDM诱导法需要大量的小鼠才能获得较充足的BMDMs。相对于RAW264.7而言，BMDM的提取复杂，增殖速度慢，诱导时间长，需要诱导因子浓度高，因此如果要进行后期的Western Blot和qPCR等实验，使用该方法时间成本与经济成本均较高。而RAW264.7 细胞可以传代和冻存，增殖速度快，诱导形成的破骨细胞数量多[16]，即使是进行后续的分子生物学研究也有足够数量的细胞进行实验，长远来看成本要低于BMDM诱导法。尽管如此，BMDM诱导法同样具有其优势。首先，BMDM来源于小鼠骨髓，细胞携带有遗传信息，体现母体的基因型，在模式动物的研究中无可替代[17-18]；其次，使用BMDM的研究更贴近实际情况，能够更好的模拟生物体内细胞的生长和分化情况[19]。尤其是针对模式动物的骨稳态研究，BMDMs的提取、诱导及干预不可避免。从小鼠的骨髓腔中获取巨噬细胞进而诱导培养形成破骨细胞的方式与体内破骨细胞的生存条件类似，因此研究得出的结论能够更好模拟骨微环境，可信度高，意义更大。

本研究采用基于M-CSF和RANKL的诱导破骨细胞分化方法，使用C57BL/6小鼠的骨髓来源巨噬细胞进行培养。BMDM分离出来后，立即进行细胞种植与分化。M-CSF能促进单核细胞向破骨细胞前体细胞分化，刺激破骨细胞前体细胞表达RANK并与RANKL结合[8]，使前体细胞融合为多核的成熟破骨细胞[1,18-21]。鉴于目前没有研究涉及BMDM传代的代数不同对其增殖及破骨分化的影响，故本研究通过形态学分析，CCK8检测及TRAP染色等实验对P0～P4代BMDM的形态，增殖能力及破骨分化能力进行对比分析。通过形态学观察，发现P0～P4代BMDM的细胞纯度逐渐增加，且形态逐渐发生变化，由小圆形或椭圆形→两端有触角伸出→长梭形→伪足伸出；同时，CCK8检测发现P0～P4代BMDM中P2代BMDM对比其余代数具有更强的增殖能力。为进一步检验P0～P4代BMDM的破骨分化能力是否存在差异，使用等浓度的M-CSF和RANKL诱导P0～P4代BMDM完成破骨分化，并进行TRAP染色实验。结果显示，P0～P4代BMDM均能发生破骨分化，其中P2代可诱导出的破骨细胞数量最多、面积最大。

综合以上论述及研究数据可得，P2组BMDM相较于其他4组纯度最高，增殖能力最强，破骨分化潜能最大。本研究为日后科研人员对BMDM的培养及诱导破骨分化的代数选择方面提供实验依据，基于基因编辑动物的原代细胞研究也会因此受益。