肉苁蓉治疗慢性肾脏病和骨质疏松症的潜在双效成分及作用机制

董家铭 吴康郁 袁德俊 张建环 徐姗姗 叶嘉丽 涂兴明*

1. 广州中医药大学，广东 广州 510405 2. 广州中医药大学第三附属医院，广东 广州 510378 3. 广州中医药大学顺德医院(佛山市顺德区中医院)，广东 佛山 528300

骨质疏松(osteoporosis，OP)是一种以骨量低下，骨组织微结构损坏，导致骨脆性增加，易发生骨折为特征的全身性骨病，是慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)的常见并发症之一[1]。在我国，成人CKD患病率已超过10 %[2]。CKD与OP联系密切，在20岁以上患有骨质疏松的妇女中约有85 %存在肾功能损伤[3]。据国际肾脏病学会(ISN) 2017—2018 年度报告(https://www.theisn.org/wp-content/uploads/2020/09/ISN_biennial_report_2019.pdf)显示，CKD 作为全球第 11大死因，每年约造成120万人死亡，是全球第 6 大增长最快的死因。慢性肾脏病-矿物质和骨异常 (CKD-MBD) 是 CKD 患者高死亡率的主要原因之一[4]。慢性肾脏病-骨质疏松症 (CKD-OP) 则是CKD-MBD 的进一步发展，其发病机制复杂，药物治疗策略上主要采取抗骨吸收药物治疗，然而，化学药物在使用时存在不同程度的限制和不良反应[5]。中医药具有“多成分、多靶点、多途径”的特点，在治疗CKD及OP方面应用历史悠久，具有独特优势，且不良反应较少，潜在应用前景较大，但其治疗机制尚需进一步明确。

肉苁蓉始载于《神农本草经》，列为上品，有填精补髓、补肾壮阳等功效[6]。研究[7-8]发现，肉苁蓉不仅能治疗骨质疏松症，还能有效地保护透析治疗的CKD患者残余肾功能，促进溶质及水分清除，提高透析充分性且无明显不良反应。此外，单味中药肉苁蓉在治疗CKD与OP方面不仅具有一定的疗效，而且不良反应较少，辩证相对简单明确，还可作为茶饮发挥持久作用，有利于提高患者配合度，但其治疗CKD-OP的双效成分和作用机制尚不明确。研究肉苁蓉治疗CKD-OP的机制对阐明肉苁蓉填精补髓、补肾壮阳的功效具有重要意义。基于此，本研究运用网络药理学的方法探讨肉苁蓉治疗CKD-OP的潜在双效成分及作用机制，并利用分子对接技术验证，以期为肉苁蓉治疗CKD-OP的临床实践提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 肉苁蓉活性成分和相关靶点筛选

首先在TCMSP (Version：2.3，https://tcmspw.com/tcmsp.php)以“roucongrong” 为 “herb name” 进行检索。按口服生物利用度(OB) ≥30 %，类药性(DL) ≥0.18筛选活性成分和靶点，并通过中国知网(https://www.cnki.net/)和PubMed数据库(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)补充因OB值<30 %或DL值<0.18而被筛掉但已有文献报道具有活性的成分和靶点。随后在Uniprot数据库(2020年8月3日更新，https://www.uniprot.org/)进行靶点注释，去除非人源及无数据靶点。最后在Cytoscape (Version：3.8.0)构建活性成分-相关靶点网络。

1.2 CKD和OP共同靶标获取

分别以“Osteoporosis”和“Chronic Kidney Disease”为检索词在DisGeNet (Version：7.0，https://www.disgenet.org/)、OMIM (2020年9月15日更新，https://www.omim.org/)、TTD(2020年6月1日更新，http://db.idrblab.net/ttd/)以及GeneCards(Version：5.0，https://www.genecards.org/)数据库检索OP和CKD相关的疾病靶点，将两者的疾病靶点各自汇合去重后导入Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)网站取交集，即得CKD-OP共同靶点。

1.3 肉苁蓉治疗CKD-OP潜在靶点获取

将肉苁蓉活性成分相关靶点和CKD-OP共同靶点导入Venny 2.1网站，取其交集，即得。

1.4 PPI网络构建

于STRING数据库(Version：11.0，https://string-db.org/)输入肉苁蓉治疗CKD-OP的潜在靶点，限定物种为“智人(Homo sapiens)”，并且设置分析条件为最高置信度(0.900)，隐藏孤立靶点即得。

1.5 核心靶点的筛选

利用CytoHubba插件对PPI网络进行分析，从自由度(Degree)、介数(Betweeness)和接近中心数(Closeness)3个维度分析潜在靶点的重要性，以大于中位数为条件筛选，3个维度分别获得的结果的交集即为核心靶点。

1.6 核心靶点GO功能和KEGG通路富集

通过DAVID数据库(Version：6.8，https://david.ncifcrf.gov/)对核心靶点进行GO功能注释和KEGG信号通路富集分析，物种和背景均选择“智人(Homo sapiens)”，分析肉苁蓉发挥治疗CKD-OP药理作用的P<0.05的前20个主要生物过程和非疾病命名、非癌症相关信号通路，使用R语言ggplot2软件进行绘图，并于Cytoscape 将构建活性成分-核心靶点-信号通路图。

1.7 关键成分的分子对接验证

根据前面得到的活性成分-核心靶点-信号通路图，选择自由度≥5的活性成分作为关键成分，自由度≥10的核心靶点作为关键靶点。分别从PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)和RCSB PDB蛋白数据库(http://www.rcsb.org/)下载结构文件，进行除水、除原配体、加氢、计算电荷等处理后，利用AutoDockTools进行关键靶点与关键成分的半柔性分子对接，设置盒子大小为X、Y、Z轴均为126，使用拉马克遗传算法，其他设置默认不变，选择结合能最低的优势构象于PyMOL 2.3.0展示。

2 结果

2.1 肉苁蓉活性成分筛选及活性成分-相关靶点网络构建

TCMSP共筛选到7个活性成分，通过CNKI和PubMed数据库补充4个活性成分，详见表1。将活性成分和经Uniprot数据库标准化的173个相关靶点导入Cytoscape 中，得到图1。

表1 肉苁蓉活性成分Table 1 Cistanche Herba active ingredients

图1 肉苁蓉活性成分-相关靶点网络图Fig.1 Cistanche Herba active ingredients-related targets network

2.2 CKD与OP共同靶点

分别得到CKD和OP相关靶点14 979和4 629个，交集得到CKD-OP共同靶点3 846个(图2)。

图2 CKD-OP疾病相关靶点交集Fig.2 CKD-OP disease-related targets intersection

2.3 肉苁蓉治疗CKD-OP潜在靶点

将肉苁蓉活性成分相关靶点与CKD-OP共同靶点映射，得到肉苁蓉治疗CKD-OP的潜在靶点132个(图3)。

图3 肉苁蓉-疾病靶点交集Fig.3 Cistanche Herba-disease targets intersection

2.4 潜在靶点PPI网络及核心靶点

潜在靶点PPI网络图(图4)经CytoHubba插件分析后，筛选出核心靶点46个(表2)。

图4 肉苁蓉潜在靶点PPI网络图Fig.4 Potential target PPI network of Cistanche Herba

2.5 核心靶点GO功能和KEGG通路富集

共获得KEGG通路99条，主要涉及TNF、HIF-1、Toll样受体等信号通路等，其中以TNF信号通路的P值最小，表明肉苁蓉通过该通路影响CKD-OP的可能性较大。GO功能494条，包括生物学过程(BP)403条，主要涉及RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、对药物的反应、DNA模板转录的正调控等；细胞定位(CC)32条，主要涉及核、细胞外间隙、核质等；分子功能(MF)59条，主要涉及相同的蛋白质结合、转录因子结合、酶结合等。根据P值各列出最小的前20名，使用R语言绘制成柱状图和气泡图，如图5和图6，柱长和气泡大小表示基因数量，颜色代表靶点富集显著性P值，富集倍数Fold Enrichment表示核心靶点在该通路基因的占比。

表2 肉苁蓉核心靶点Table 2 Cistanche Herba core targets

2.6 “活性成分-核心靶点-信号通路”网络构建以及分子对接对象选择

“活性成分-核心靶点-信号通路”网络图(图7)显示，得到关键成分3个(槲皮素、β-谷甾醇、红景天苷)和关键靶点6个(AKT1、MAPK1、JUN、TNF、RELA和PTGS2)。

2.7 分子对接

肉苁蓉关键成分与相应的关键靶点的结合能均小于-5 kcal/mol (图8)。一般认为，配体与受体之间的结合能越低，其构象越稳定，结合能≤-5 kcal/mol说

图6 肉苁蓉KEGG通路富集图Fig.6 KEGG pathway Enrichment analysis of Cistanche Herba

注：黄色表示与PTGS2存在关联的节点。图7 活性成分-核心靶点-信号通路网络图Fig.7 Active ingredients-core targets-signal pathways network

图8 肉苁蓉关键成分的分子对接结果Fig.8 Molecular docking results of key ingredients of Cistanche Herba

注：A：β-谷甾醇+PTGS2；B：槲皮素+PTGS2；C：红景天苷+PTGS2。绿色条带为蛋白，粉色棍状结构为药物分子，黄色连线为氢键，数字代表其距离，其余棍状结构为蛋白对接残基。图9 肉苁蓉治疗CKD-OP关键成分与PTGS2分子对接位点Fig.9 Key components of Cistanche for preventing CKD-OP and docking site of PTGS2

明两者可以结合，≤-7 kcal/mol则表明两者结合活性较好[9]。在6个靶点中，PTGS2是3个关键成分的共同靶点，且结合能均小于-7 kcal/mol，是6个关键靶点与关键成分中平均结合能最低的靶点(-9.416 6 kcal/mol)，其与β-谷甾醇形成3个关键成分和6个关键靶点之间的最优构象。另外，由图7可知，PTGS2还可被肉苁蓉其他活性成分影响，表明PTGS2可能是肉苁蓉影响CKD-OP的主要关键靶点，其主要对应TNF信号通路、NF-κB信号通路和Oxytocin 信号通路，该分子对接验证结果与DAVID数据库分析预测结果相符。PTGS2和槲皮素、红景天苷、β谷甾醇的分子对接模型如图9所示。

3 讨论

随着人口老龄化的进展以及人们生活方式的改变，OP和CKD的发病率逐年增加，成为了一个重要的公共卫生问题，如何防范化解国内约1.195亿[10]CKD患者带来的OP患病风险将可能成为“健康中国行动”背景下值得思考的课题。

CKD-OP的发病机制复杂，涉及范围广，单一化学药物治疗难度较大且存在不同程度的不良反应[11]。中医药治疗肾脏疾病和骨病已有几千年历史，不良反应少、疗效独特的特点使其应用得到越来越多的关注，但具体分子机制尚未明确。本研究基于网络药理学方法和分子对接技术发现肉苁蓉可通过β-谷甾醇、槲皮素、红景天苷和AKT1、MAPK1、JUN、TNF、RELA和PTGS2影响CKD-OP，所涉及的信号通路主要有：TNF信号通路、NF-κB信号通路和Oxytocin 信号通路等，其中β-谷甾醇、槲皮素、PTGS2以及TNF信号通路可能是影响比较大的主要因素。

PTGS2也称环氧合酶-2(COX-2)，是花生四烯酸转化为炎症性前列腺素的主要同工酶，可影响CKD和OP的发病过程[12]。研究表明，槲皮素对破骨细胞的形成、增殖和成熟均有抑制作用，同时还能促进成骨细胞的生长，其机制与抑制PTGS2表达、抑制NF-κB激活、恢复TNF-α正常水平等有关[13]。此外，槲皮素还能通过抑制PTGS2、TNFα，调节MAPK和NF-κB信号通路保护肾脏，且呈剂量依赖性[14]。而红景天苷也被证明可减少软骨细胞PTGS2的表达，抑制NF-κB的激活[15]。在肾脏保护方面，红景天苷能减少TNF-α的释放，抑制NF-κB和MAPK信号通路，改善肾间质纤维化[16]。β-谷甾醇则可降低TNFα、PTGS2、NF-κB的表达，抑制炎症，发挥骨保护和肾保护作用[17-18]。

综上，肉苁蓉通过“多成分-多靶点-多途径”治疗CKD-OP，β-谷甾醇、槲皮素和红景天苷是肉苁蓉治疗CKD-OP的双效成分，其主要机制可能与PTGS2调控TNF 信号通路有关，该研究有待应用适宜的细胞、动物模型进行实验论证。