通督调神针刺对脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能及VEGF、NGF、MBP表达的影响❋

刘 燕， 王陈妮， 兰 崴， 唐 巍△

(1.安庆医药高等专科学校中医康复教研室，安徽 安庆 246052；2.安徽中医药大学针灸推拿学院， 合肥 230012)

脑缺血再灌注损伤是缺血性脑卒中的重要病理生理机制，大脑缺血时间过长引起大脑生物电功能调控异常，造成不可逆的神经损伤，在恢复血供的同时还会引起更严重的脑组织损伤[1]。中医针刺疗法对缺血性脑卒中一直有良好的效果，得到国内外广泛认可[2，3]。中医认为，该病治疗当以通督调神为原则，督脉循行于脊里，上络于脑，与脑和脊髓关系密切。针刺治疗时以督脉穴位为主，通督脉以调元神，辅以心包经穴位，调整气血运行进而达到调脑神的作用。临床研究发现，通督调神针刺可明显促进中风患者的神经功能恢复[4]，不过相关动物实验研究较少，病理机制尚不明朗。既往文献显示，神经损伤修复和再生与血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、神经生长因子(nerve growth factor，NGF)、髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)有关[5，6]。本实验构建大鼠脑缺血再灌注损伤模型，从VEGF、NGF、MBP蛋白表达观察通督调神针刺对大鼠神经功能恢复的影响，并探讨其可能的作用机制。本研究通过安徽中医药大学实验动物伦理委员会批准(批号AHUCM-rats-2020006)。

1 材料与方法

1.1 动物

健康雄性SD大鼠40只，体质量(240±15)g，购自上海斯莱克实验动物有限公司。实验前均适应性喂养1周，室温22～24 ℃，湿度55%～65%，自然光照，普通饲料投喂，自由进食饮水。

1.2 主要试剂与仪器

一次性使用无菌针灸针(0.25 mm×40 mm)，苏州医疗用品厂有限公司；丁苯酞氯化钠注射液(规格100 mL:25 mg)，购自石药集团恩必普药业有限公司。VEGF抗体试剂盒(Hzbscience，货号HZ-VEGF-Ra)，购自上海泽叶生物科技有限公司；NGF抗体试剂盒(百奥莱博，货号ARB11095)，购自北京百奥莱博科技有限公司； MBP抗体试剂盒(TargetMol，货号TP1092)，购自上海广锐生物科技有限公司；DYCP31DN聚丙烯酰胺凝胶电泳仪，购自北京六一生物科技有限公司。

1.3 模型制备

大鼠脑缺血再灌注损伤模型参考改良Koizumi线栓法，通过尼龙线阻断大脑中动脉，即可造成大鼠局灶性脑缺血[7]。具体制备方法：大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，等待5～10 min观察到大鼠腹式呼吸表明麻醉成功。将大鼠四肢绑在实验台上，仰卧位，颈部备皮，碘伏消毒，切开颈正中皮肤，钝性分离颈部肌肉组织，暴露颈部血管，游离左侧颈总动脉，穿入尼龙线结扎颈外动脉，动脉夹暂时夹闭主动脉，插入自制线栓至颈内动脉，插线深度约2 cm，遇到阻力即可。将缺血时间控制在2 h，抽出尼龙线线栓完成再灌注，将再灌注时间控制在24 h。假手术组除不结扎大脑中动脉外，麻醉、切开皮肤等步骤同上。模型组、药物组、针刺组均按此方法制备脑缺血再灌注大鼠模型。

1.4 分组及干预方法

采用随机数字表法将40只大鼠分为假手术组、模型组、药物组、针刺组4组各10只。假手术组与模型组不给予任何治疗措施，正常喂养。药物组再灌注24 h后，腹腔注射丁苯酞氯化钠注射液10 mg/(kg·d)，每日1次，7 d为1个疗程。针刺组再灌注24 h后，给予通督调神针刺，每日1次，7 d为1个疗程。具体针刺部位与方法参照大鼠穴位图谱[8]，针刺“风池”“足三里”“曲池穴”“合谷穴”“三阴交”(见表1)。

表1 大鼠通督调神针刺穴位定位及针刺方法

1.5 神经功能评价

大鼠神经功能缺损评分(neurological severity scores，NSS)计算标准：神经功能正常=0分，提起大鼠尾巴时左前肢屈曲(轻度缺损)=1分，大鼠行走时向左侧转圈(中度缺损)=2分，大鼠行走时向左侧倾斜(重度缺损)=3分，大鼠不能自发行走、意识减退甚至丧失=4分，与缺血有关的死亡=5分[9]。模型制备后立即评分(治疗前的评分)，1～3分表示脑缺血再灌注模型制备成功。各组大鼠在治疗或喂养7 d后再次评分。

1.6 取材方法

NSS评分完成后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉。每组取5只大鼠打开胸腔暴露心脏，4%多聚乙醛灌注，断头摘取大脑缺血组织制作石蜡切片，用于常规病理HE染色与免疫组化SP染色。每组取另外5只大鼠麻醉后直接断头取脑，大脑缺血组织匀浆用于Western blot检测。

1.7 免疫组化法检测VEGF、NGF、MBP蛋白表达

石蜡切片经500 mL抗原修复工作液处理后，磷酸盐缓冲液冲洗5 min，晾干后滴加10%非免疫羊血清，孵育30 min。免疫组化SP染色：以磷酸盐缓冲液作为阴性对照，切片加入VEGF、NGF、MBP一抗(1∶200)，4 ℃孵育过夜。再加入辣根过氧化物酶标记的二抗，37 ℃孵育30 min，磷酸盐缓冲液冲洗3次，每次5 min。再加入二氨基联苯胺显色液50 μL，染色5 min，切片置于显微镜下观察。评价标准：细胞被染成棕黄色为阳性，计算每张切片的平均阳性细胞百分比[10]。

1.8 Western blot法检测VEGF、NGF、MBP蛋白表达

取大鼠脑缺血组织200 μg，加入适量蛋白裂解液匀浆离心后取上清，加入适量磷酸盐缓冲液调整所有大鼠组织样本为相同浓度。加入VEGF、NGF、MBP一抗工作液(1∶1000)，4 ℃孵育过夜。再加入二抗工作液，37 ℃孵育30 min，电泳、转膜、脱色、曝光显影。以β-actin为内参，使用Image J软件测量目的蛋白相对灰度值。目的蛋白相对灰度值=目的蛋白/β-actin的灰度值。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠治疗前后NSS评分比较

模型组、药物组、针刺组大鼠治疗前NSS评分比较差异无统计学意义(P>0.05)。药物组、针刺组大鼠治疗后NSS评分均明显低于治疗前(P<0.05)。药物组大鼠治疗后NSS评分明显低于模型组(P<0.05)，针刺组大鼠治疗后NSS评分明显低于模型组和药物组(P<0.05)(见图1)。

注：与假手术组比较：*P<0.05；与模型组比较：▲P<0.05；与药物组比较：#P<0.05；与治疗前比较：△P<0.05图1 各组大鼠治疗前后神经功能缺损评分比较(Neurological Severity Scores，NSS)

2.2 各组大鼠脑缺血组织HE染色结果

假手术组大鼠脑缺血组织细胞层次整齐，结构完整，细胞核被染成紫蓝色，细胞核形态完整，细胞质被染成红色，胞浆丰富，染色均匀(图2A)。模型组大鼠脑缺血组织细胞排列疏松，细胞肿胀，可见大量坏死细胞，细胞核固缩，核仁模糊，细胞质水肿，胞浆减少(图2B)。药物组大鼠脑缺血组织中正常形态细胞数目减少，细胞染色形态与模型组类似，与模型组比较，坏死细胞数目较少，部分细胞完整(图2C)。针刺组大鼠脑缺血组织中正常形态细胞数目减少，细胞染色形态与模型组类似，与模型组比较，坏死细胞数目较少，出现胶质细胞与胶原纤维增生(图2D)。

注：A.假手术组；B.模型组；C.药物组；D.针刺组图2 各组大鼠脑缺血组织HE染色比较(×100)

2.3 各组大鼠脑缺血组织VEGF表达比较

根据免疫组化染色测定VEGF表达的阳性细胞百分比，以及Western blot法测定VEGF表达的相对灰度值，结果显示，模型组大鼠脑缺血组织中的VEGF表达高于假手术组(P<0.05)，药物组大鼠脑缺血组织中VEGF表达高于模型组(P<0.05)，针刺组大鼠脑缺血组织中的VEGF表达高于模型组和药物组(P<0.05)(见图3、4)。

注：A.假手术组；B.模型组；C.药物组；D.针刺组；与假手术组比较：*P<0.05；与模型组比较：▲P<0.05；与药物组比较：#P<0.05图3 各组大鼠脑缺血组织血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)免疫组化SP染色比较(×400)

注：与假手术组比较：*P<0.05；与模型组比较：▲P<0.05；与药物组比较：#P<0.05图4 各组大鼠脑缺血组织血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)Western blot条带比较

2.4 各组大鼠脑缺血组织NGF表达比较

根据免疫组化染色测定NGF表达的阳性细胞百分比，以及Western blot法测定NGF表达的相对灰度值，结果显示，模型组大鼠脑缺血组织中的NGF表达高于假手术组(P<0.05)，药物组大鼠脑缺血组织中的NGF表达高于模型组(P<0.05)，针刺组大鼠脑缺血组织中的NGF表达高于模型组和药物组(P<0.05)(见图5、6)。

2.5 各组大鼠脑缺血组织MBP表达比较

根据免疫组化染色测定MBP的阳性细胞百分比以及Western blot法测定MBP表达的相对灰度值，结果显示，模型组大鼠脑缺血组织中的MBP表达低于假手术组(P<0.05)，药物组大鼠脑缺血组织中的MBP表达高于模型组(P<0.05)，针刺组大鼠脑缺血组织中MBP表达高于模型组和药物组(P<0.05)(见图7、8)。

注：A.假手术组；B.模型组；C.药物组；D.针刺组；与假手术组比较：*P<0.05；与模型组比较：▲P<0.05；与药物组比较：#P<0.05图7 各组大鼠脑缺血组织髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)的免疫组化SP染色比较(×400)

注：与假手术组比较：*P<0.05；与模型组比较：▲P<0.05；与药物组比较：#P<0.05图8 各组大鼠脑缺血组织髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)Western blot条带比较

3 讨论

脑缺血疾病属于中风范畴，中医认为大脑功能与五脏关系密切，心主神明，脑为髓海。中风的病机经络辨证为督脉气衰、阳气不振，督脉痹阻则气血滞留，血液运行不畅[11]。督脉为阳脉之海，总督诸阳，因此通督脉以调元神可达阴平阳秘、形神协调之功，辅以心包经穴位，进一步疏通经络、醒脑开窍。本实验选择的通督调神针刺包含风池、足三里、曲池、合谷、三阴交5处穴位，风池主中风偏枯、少阳头痛，乃风邪蓄积之所；曲池调和气血、疏经通络，主治半身不遂；合谷属阳主表，宣通气血；合谷升而能散；曲池走而不守；足三里调理肝脾，补益气血；三阴交健脾和胃、调补肝肾、疏经通络。有研究报道，通督调神针刺治疗能有效改善患者脑组织低灌注区的脑血流量，疏经通络，调和气血[12，13]。上述经络理论与脑缺血疾病的病理生理基础相互联系，可为针刺治疗提供理论基础。

脑缺血再灌注损伤是导致神经功能缺损的重要原因，其生物学机制可能与神经干细胞自由基增加、脂质过氧化、兴奋性氨基酸毒性等有关[14，15]。脑缺血发生后，大脑血氧供给不足，神经细胞代谢的废物堆积，产生炎症细胞因子、趋化因子、氧自由基等，直接损伤神经细胞以及血管内皮细胞。本研究对脑缺血再灌注损伤大鼠实施通督调神针刺，结果显示针刺组大鼠治疗后NSS评分较治疗前明显降低，且低于模型组和药物组，说明通督调神针刺能够明显改善脑缺血再灌注损伤大鼠的神经功能，减轻脑缺血再灌注损伤。与谷诗浓等[16]报道的通督调神针法可改善脑缺血再灌注损伤大鼠脑梗死范围，减少脑神经细胞凋亡，进而保护神经功能的研究结果一致。另外，药物组大鼠给予丁苯酞氯化钠注射液为阳性对照。国外研究显示，丁苯酞可治疗缺血性脑卒中，改善患者中枢神经功能损伤，具有较强的抗脑血栓作用，还能减轻脑水肿，改善缺血脑区的微循环，调节脑血流量、营养神经，促进患者神经功能损害的恢复[17，18]。一项实验研究也发现，丁苯酞氯化钠注射液能明显缩小大鼠的脑缺血病灶，抑制神经细胞凋亡[19]。目前认为丁苯酞的药理机制为靶向抑制环氧化酶，降低花生四烯酸水平，减少前列腺素的合成，减轻脑缺血再灌注后的炎症反应以及氧化应激损伤，提高血管内皮功能，维持血脑屏障的稳态。

本研究发现，模型组VEGF与NGF表达较假手术组升高，且治疗后药物组与针刺组VEGF与NGF表达升高更显著。分析其原因可能VEGF是血管生成的重要诱导因子，VEGF的表达与血管内皮功能密切相关，受到一氧化氮等因子调控。既往研究报道，脑缺血缺氧会诱导VEGF表达，VEGF增加促进神经细胞修复[20，21]，与本研究结果中模型组VEGF表达升高一致。治疗后药物组与针刺组VEGF升高更显著，可能是因为VEGF属于血管生成诱导因子，在药物或者针刺的治疗下，VEGF升高能够发挥神经细胞修复作用。NGF为促进神经细胞生长、发育、分化、修复的重要因子。本研究发现，模型组NGF表达上调，可能与发生神经细胞损伤时，NGF表达可负反馈性上升有关，NGF通过抑制毒性氨基酸、氧自由基释放，减少细胞凋亡，从而阻止脑缺血再灌注损伤，减轻继发的病理损害[22]。治疗后药物组、针刺组的NGF表达均明显增加，提高了神经细胞损伤修复的速度，促进了神经细胞营养代谢。Chang等[23]研究探讨针刺对神经再生的作用，也发现针刺能够上调NGF等多种神经生长因子水平，促进神经保护和神经再生作用，增加脑血流量，调节氧化应激，减轻谷氨酸兴奋毒性，维持血脑屏障完整性，抑制细胞凋亡。MBP是神经少突细胞和施万细胞分泌的髓鞘蛋白质，主要功能为保护髓鞘，维持髓鞘功能稳定，在正常神经细胞中MBP表达较高，而当发生脑损伤后MBP表达下降[24]，这可以解释本研究中模型组大鼠MBP表达降低，模型组MBP水平变化与VEGF、NGF的变化不一致，可能与VEGF、NGF是促进血管或神经生成的诱导因子，而MBP属于髓鞘蛋白质，其本身是神经细胞轴突结构之一有关。经过治疗，药物组、针刺组的MBP表达相比模型组有一定提高，但仍低于假手术组，说明通督调神针刺能够上调MBP表达，促进脑缺血区的神经髓鞘组织再生。Meta分析也发现，督脉针刺可以通过调控MBP的表达诱导神经再生，从而起到治疗缺血性脑病的作用[25]。

综上所述，通督调神针刺能够明显改善脑缺血再灌注损伤大鼠的神经功能，具体机制可能与针刺上调VEGF、NGF、MBP表达进而营养神经、促进神经髓鞘组织再生有关。