田东县祥周镇肉鸡腹泻3种细菌病流行病学调查分析

罗翔，黄宝学 ，曾如笔，陆志方，鲍锋光

(1.田东县祥周镇水产畜牧兽医站，广西 田东 531502；2.田东县动物疫病预防控制中心，广西 田东 531500； 3.田东县畜牧技术推广站，广西 田东 531500)

肉鸡细菌性腹泻是养鸡业生产中常见的疾病，主要由禽大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌及沙门氏菌3种细菌感染引起发病[1]。大肠杆菌与巴氏杆菌为条件性致病菌，可以在鸡的呼吸道和消化道存在，沙门氏菌随带菌鸡粪便排出体外后仍可继续繁殖，环境污染面大[2]，不同日龄阶段的鸡易感性强。当鸡抵抗力下降时，这3种病原菌感染鸡时均能引起消化道代谢紊乱，从而引起鸡腹泻并常继发或混合感染其他病原，造成鸡发病率和死亡率上升，料肉比高，死淘率增加，鸡群均匀度差，鸡只生长受阻，发育不良，严重影响鸡群的生产性能和经济效益。为有效控制该病的发生与流行，2021年笔者通过对初诊发现存在发病的田东县祥周镇20个规模肉鸡场(户)开展流行病学调查，采集59份样品送兽医实验室进行检测，重点分析3种病原菌感染情况并进行药敏试验，探讨疾病的发病原因和防治措施，为今后防控肉鸡细菌性腹泻提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 病料来源

2021年1—12月，收集田东县祥周镇20个规模肉鸡场(户)患有腹泻症状且剖检可见典型的鸡大肠杆菌病、沙门氏菌病、巴氏杆菌病单一或混合病变特征的病死鸡或濒死鸡的病料59份(心、肝、脾)。每个鸡场采集不超过3份。

1.2 主要试剂

鲜血琼脂培养基、麦康凯琼脂平板、伊红美蓝平板培养基、SS琼脂培养基、胰蛋白大豆琼脂平板培养基(TSA、含10%血清)、营养琼脂平板培养基、普通肉汤培养基、生化试验用培养基、生化反应管。药敏试验药敏纸片：阿莫西林、头孢曲松、新霉素、土霉素、丁胺卡那、恩诺沙星、磺胺二甲氧嘧啶、氟苯尼考。以上试剂均购自广东省环凯生物科技有限公司。

1.3 实验动物

1日龄商品肉雏鸡300只、小白兔30只。

1.4 流行病学调查

深入养鸡场询问了解饲养的数量、病史和治疗用药等情况，对死亡和腹泻症状明显的鸡只进行剖检并记录病理变化。

1.5 细菌病原诊断

1.5.1细菌的分离培养

第一阶段：将每份病料同时划线接种于鲜血琼脂培养基和麦康凯琼脂平板，置于37℃培养24h，初步培养出不同的菌落。第二阶段：在第一阶段的麦康凯琼脂上分别挑取典型大肠杆菌与沙门氏菌的优势菌落分别继续接种到伊红美蓝琼脂和SS琼脂培养基上，37℃培养24h，挑取优势菌落进行涂片革兰氏镜检，将镜检结果为大肠杆菌和沙门氏菌的菌落分别在不同的营养琼脂平板进一步划线纯化，获得纯培养物后，置4℃冰箱备用。在第一阶段的鲜血琼脂培养基上挑取典型巴氏杆菌优势菌落继续接种到TSA平板培养基上37℃培养24h，挑取优势菌落进行涂片革兰氏镜检，将镜检结果为巴氏杆菌的菌落在普通肉汤培养基上进一步划线纯化，获得纯培养物后，置4℃冰箱备用。

1.5.2生化试验

取各细菌的纯培养物分别接种于葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、靛基质、明胶、尿素酶、MR试验、VP试验的生化鉴定管，37℃ 培养24h，观察并记录反应结果。

1.6 药敏试验

挑取经生化鉴定确认为大肠杆菌、沙门氏菌与巴氏杆菌的分离菌株，参照徐强[3]的纸片扩散法，对8种药物进行药敏试验。分别将分离菌制成菌悬液，后将菌悬液均匀涂布于营养琼脂培养基适当位置，待菌液被完全吸收后，将各药敏纸片贴于培养基表面，37℃培养24h，测量抑菌圈直径大小。参照试剂说明书进行判定。

1.7 致病性实验

将1日龄雏鸡饲养3d，挑选236只健康雏鸡，随机分为59组，每组4只，57组设为试验组，另2组设为对照组。34个试验组雏鸡皮下注射不同的大肠杆菌分离菌肉汤培养物、23个试验组雏鸡皮下注射不同的沙门氏菌分离菌肉汤培养物，0.2mL/只；对照组无菌注射生理盐水0.2mL/只。挑选健康小白兔26只，随机分成13组，设试验组12组，对照组1组。试验组用不同的巴氏杆菌肉汤培养物皮下注射，0.2mL/只，对照组无菌注射生理盐水0.2mL/只。接种后，每隔4h观察记录鸡与小白兔的发病情况。

2 结果

2.1 流行病学调查结果

共调查鸡只62516羽，均有腹泻症状，总体发病率33.62%，死亡率 11.3%，病死率33.62%。3种细菌病在不同日龄鸡中均有发生，大肠杆菌病主要侵害31～60日龄的肉鸡，沙门氏菌病主要发生于30日龄以内的肉仔鸡，巴氏杆菌病主要发生于60日龄以上的肉鸡。双重感染的治愈率比单一感染病例低，转良时间比单一感染长2～3d。多数鸡场发现鸡群发生腹泻后不考虑发病原因，直接使用氨基糖苷类抗生素药物，存在不合理使用甚至滥用抗生素的情况。

2.2 细菌病原学检测结果

2.2.1细菌的分离培养结果

对59份样品经过第一阶段与第二阶段的细菌分离培养后，有34株细菌疑似大肠杆菌：这34株细菌在麦康凯琼脂平板培养基上形成红色菌落；在伊红美蓝琼脂平板上形成圆形稍隆起、黑色带金属闪光的菌落，直径约为2.5mm；在营养琼脂上形成圆形凸起、半透明、灰白色的菌落；镜检发现细菌革兰氏染色阴性、散在或成对、两端钝圆的杆菌，由此初步鉴定这34株细菌为大肠杆菌。有23株细菌疑似沙门氏菌：这23株细菌在麦康凯琼脂平板上形成圆形光滑隆起、灰白色的小菌落；在SS琼脂培养基上形成淡红色菌落，菌落中心有黑褐色；营养琼脂平板上形成无色半透明、圆形、边缘整齐的小菌落；染色镜检为革兰氏阴性杆菌、大小均一、多散在、无芽孢和荚膜，初步鉴定这23株为沙门氏菌。有12株细菌疑似巴氏杆菌：这12株细菌在鲜血琼脂平板上长出灰白色露珠样针尖大小菌落，菌落周围不溶血；在TSA培养基上形成光滑、湿润的水滴样小菌落；普通肉汤培养基表面形成菌环，管底有黏稠沉淀；在麦康凯琼脂平板培养基上不生长；染色镜检可见两端钝圆、中央微凸、单个或成双排列的革兰氏阴性小杆菌，初步鉴定这12株为巴氏杆菌。

2.2.2生化试验结果

通过对34株可疑大肠杆菌、23株可疑沙门氏菌、12株可疑多杀性巴氏杆菌分别进行10项生化项目鉴定，结果表明本次分离的菌株符合大肠杆菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌的生化特性。见表1。

表1 分离菌生化试验结果

2.2.3病料组织检测结果

在59份样品中，检出大肠杆菌34份，占57.63%；沙门氏菌23份，占38.98%；巴氏杆菌12份，占20.34%。单一感染样品数为49份，占样品总数的83.05%，双重感染样品数为10份，占样品总数的16.95%，均为大肠杆菌与沙门氏菌或巴氏杆菌共感染。见表2。

2.3 药敏试验结果

对大肠杆菌分离株34株、沙门氏菌23株、巴氏杆菌12株进行8种抗生素的药敏试验，大肠杆菌对土霉素耐药率(94.12%)最高，其次为磺胺二甲氧嘧啶(73.53%)；沙门氏菌对阿莫西林、磺胺二甲氧嘧啶耐药率(82.61%)最高，其次为恩诺沙星(65.22%)；巴氏杆菌对头孢曲松耐药率(83.33%)最高，其次为阿莫西林(75%)。3种细菌均为多重耐药菌株，见表3。

表2 病料组织检测结果

表3 药敏试验结果

2.4 致病性试验结果

大肠杆菌试验鸡于接种后8h陆续开始发病，表现为精神沉郁、拒食或少食、白色腹泻粪便、肌肉干瘪、肛羽污湿，24h后开始陆续死亡 。接种后总体发病率达89.62%，死亡率为78.68%，生理盐水对照组感染率为0。从病死鸡的心、肝组织中可回收到致病菌，表明试验的34株菌为致病性大肠杆菌。沙门氏菌试验鸡于接种后6h陆续开始发病，表现为下痢、拉白色糊状粪便、肛门周围羽毛被粪便污染、排便困难、有尖叫声，12h后开始死亡。接种后总体发病率达100%，死亡率为89.13%，生理盐水对照组感染率为0。从病死鸡的心、肝组织中可回收到细菌，表明试验的23株菌为致病性沙门氏菌。巴氏杆菌攻毒后16～24h, 试验组小白兔全部死亡，2只对照组小白兔健康存活。取死亡小白兔肝脏涂片染色镜检并同时分离培养, 可见卵圆形小杆菌, 细菌的形态、染色特征与初次分离的细菌相同，表明试验的12株菌为巴氏杆菌。

3 讨论

本调查涵盖田东县祥周镇20个养鸡场(户)，在临床症状、病理剖检、收集有关流行病学资料等的基础上对59份疑似感染大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌鸡组织进行细菌分离鉴定检测，检测结果基本能够反映当前田东县祥周镇肉鸡细菌性腹泻主要病原菌的感染流行情况。通过对收集到的59份病料分离鉴定，感染率由高到低依次为大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌。大肠杆菌总分离率为57.63%，低于曹民川[4]、宋玉伟[5]等报道的陕西省铜川市、河南省许昌地区大肠杆菌分离率66.67%、100%。沙门氏菌总分离率为38.98%，低于元振杰[6]等报道的西藏鸡沙门氏菌分离率57.65%。巴氏杆菌总分离率为20.34%。不同地区分离率的差异，可能与鸡群为单一感染或混合感染、临床诊断的准确性、采样前已使用抗生素药物治疗、发病程度、病程长短、采样地点的鸡场兽医卫生状况等因素有关。大肠杆菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌是当前造成田东县祥周镇肉鸡细菌性腹泻的主要病原, 在鸡群中普遍存在，对不同日龄、性别、品种的肉鸡均可感染，不但可以单一感染, 还可以混合感染 ，对养鸡业的危害日益严重。收集病料中单一感染占总样品数的83.05%(49/59), 混合感染占总样品数的16.95%(10/59)，不同感染类型给鸡场造成了不同程度的死亡，双重感染治愈率最低且疾病转良时间最长。提示养鸡场(户)肉鸡一旦发生腹泻，在流行病学调查的基础上应首先进行病原菌的分离鉴定，找出引起感染的主要病原，确定感染病原类型后再制定防治方案，有针对性地进行防控。

致病性试验结果表明，3种病原分离菌均具有强致病性且均可引起鸡腹泻，其中沙门氏菌引起雏鸡的发病率与死亡率最高，发病率达100%，死亡率为89.13% ，这与元振杰[6]等、王亮[7]等致病性试验得出的发病率与死亡率结果基本相符。鸡场一旦发病会导致大量的雏鸡死亡[8]，提示养殖场(户)在育雏阶段要重点做好沙门氏菌的防控，减少其造成的经济损失。沙门氏菌主要通过垂直与水平两种传播途径感染，生产上引进雏鸡要严格检疫，要提升饲养管理水平，严格执行全进全出饲养模式，定期做好圈舍内外的环境卫生消毒，在不同饲养阶段对不同日龄的雏鸡给予适宜的养殖密度，同时要做好通风、防寒保暖，保持舍内干燥，提高环境饲养质量，防止鸡群应激反应。在用药物治疗病鸡时，除了使用抗生素杀灭沙门氏菌外还要考虑革兰氏阴性菌在死亡后会产生大量的内毒素，内毒素对病鸡的内脏器官会产生严重的毒害作用，在治疗时要加入鱼腥草等抗内毒素中药[9]。

由于大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌血清型众多，且不同血清型间缺乏交叉保护力，故疫苗免疫接种不作为首选的预防手段，目前，还是要通过药物防治来控制疫病的发生。调查发现，多数鸡场用抗生素治疗肉鸡细菌性腹泻时，重复使用单一药物且盲目加大用量，但效果欠佳。抗菌药物的不合理使用给养殖生产增加了成本，增加病原菌耐药性[10]，破坏鸡群肠道菌群，增加治疗难度。当前，许多学者[11-13]在广西不同地区分离的鸡源致病性大肠杆菌、鸡源致病性沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌普遍存在多重耐药现象。本研究对所获得的3种病原菌致病性分离株进行目前临床常用的8种抗生素药敏试验,发现3种病原菌的耐药性都非常严重，大肠杆菌和巴氏杆菌呈5种耐药，沙门氏菌呈6种耐药，且有交叉耐药现象，都对阿莫西林、土霉素、磺胺二甲氧嘧啶3种药物的耐药率超过15%。在临床控制鸡细菌性腹泻的过程中，应结合病原菌检测、耐药性分析结果，制定科学、合理的治疗方案。