大理州鸡源沙门氏菌的分离鉴定及耐药性分析

陈富珍，陈丽英，王乔花，赵蓉，黄建新，曹荣昌，李珂*

(1.大理农林职业技术学院，云南 大理 671003； 2.云南省畜牧兽医科学院养禽与禽病研究所，云南 昆明 650224； 3.云南农业大学动物医学院，云南 昆明 650201)

沙门氏菌(Salmonella)是革兰氏阴性杆菌，宿主范围广，是人和动物常见的共患病病原体之一，能够引起人类的伤寒热、腹泻、食物中毒和败血症等，给社会和经济发展造成巨大损失[1]。沙门氏菌属可引起鸡沙门氏菌病，主要包含鸡白痢、鸡伤寒、鸡副伤寒等，雏鸡感染后死亡率高，成年鸡群感染后生产性能大幅降低，给养鸡业造成重大危害和经济损失[2]。近几年，大理州不断加快推进畜禽业发展，有效保障全州乃至滇西人民“菜篮子”的肉食供应，其中养禽业特别是养鸡业贡献了巨大的力量。随着现代养鸡商业化及养殖规模的扩大，鸡沙门氏菌的传播更加复杂[3]，加之长期以来，由于抗生素的不科学使用，沙门氏菌的耐药菌株不断产生，不同地区菌株耐药性不尽相同，严重影响了临床防治效果，同时多种抗生素的不规范使用也严重危害人类的食品安全[4，5]。为了解大理州鸡群沙门氏菌病流行情况及耐药现状，对大理州疑似感染发病鸡群进行相关试验，为健康养鸡、有效防控该病提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1病料来源

2020—2021年，采自大理州祥云、云龙、弥渡等9个县(市)的规模场及散养场(户)疑似感染鸡沙门氏菌病的病鸡肝脏组织，共计15份病料，-50℃冰箱冻存备用。

1.1.2培养基与试剂

沙门志贺菌属琼脂培养基(SS)、麦康凯琼脂培养基(MAC)、RV沙门菌增菌液体培养基、细菌微量生化反应管均购自广东环凯微生物科技有限公司；药敏试纸片购自杭州天和微生物试剂有限公司；沙门氏菌属诊断血清购自宁波天润生物药业有限公司；细菌组DNA提取试剂盒、2×Taq PCR MasterMix购自天根生化科技(北京)有限公司；革兰氏染色液及其他常规试剂由大理农林职业技术学院实验室提供。

1.1.3仪器和设备

数显生化培养箱(上海虔钧科学仪器有限公司)、全自动高压蒸汽灭菌锅(上海博迅)、电热恒温干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)、电子天平(奥豪斯仪器有限公司)、无菌超净工作台(苏州净化)、双目生物显微镜〔奥林巴斯(中国)有限公司〕、PCR扩增仪(北京赛智创业科技有限公司)、电泳仪(北京六一生物科技有限公司)、标准玻片等。

1.2 方法

1.2.1病原菌的分离培养

无菌操作，分别采集发病鸡的肝脏组织1g，加入5mL RV沙门菌增菌液中，37℃培养12h，用于沙门氏菌选择性增菌培养。用接种环蘸取菌液分别在麦康凯琼脂培养基(MAC)和SS琼脂培养基上进行划线，生化培养箱中37℃培养18～24h，再挑取可疑单个菌落接种于SS琼脂培养基上进行纯培养。

1.2.2染色镜检

用接种环挑取纯化培养后疑似沙门氏菌的单个菌落均匀涂抹在事先准备好滴有一滴蒸馏水的载玻片上，自然晾干，火焰固定，革兰氏染色干燥后镜检。

1.2.3生化试验

分别对分离纯化的疑似病原菌挑取单个菌落，接种于生化反应管中，37℃孵育48h后观察结果。生化反应试验包括：三糖铁试验、尿素试验、赖氨酸脱羧酶试验、山梨醇试验、甘露醇试验、靛基质试验、氰化钾试验、β-半乳糖苷(ONPG)试验等。

1.2.4血清型鉴定

用生理盐水制备菌悬液，按照沙门氏菌属诊断血清说明书进行，先取诊断血清1～2滴于洁净玻片上，后取少量待检菌苔与血清混匀，轻轻摇动玻片，1min内呈现明显凝集者为阳性，呈均匀浑浊者为阴性，同时用生理盐水设置阴性对照试验。

1.2.5分离菌株多重PCR鉴定

按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书操作，提取分离纯化后的菌株DNA。根据禽沙门氏菌病诊断技术(NY/T 2838—2015)方法进行沙门氏菌多重PCR鉴定。引物及PCR产物大小，见表1。PCR扩增体系：2×Taq PCR MasterMix 12.5μL、10nmol/μL混合引物5μL、ddH2O 6.5μL、DNA模板1μL，总体积25μL。反应条件：94℃预变性4min，94℃变性45s、56℃退火30s、72℃延伸45s，30个循环，72℃延伸10min；4℃保存。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

表 1 引物及PCR产物大小

1.2.6药敏试验

采用药敏纸片扩散法(K-B)测定分离株对28种临床抗菌药物的敏感性。在SS琼脂培养基上均匀涂布待测菌株，贴好药敏片后于37 ℃恒温生化培养箱中培养18～24h，观察并测量抑菌圈直径的大小，依据美国临床实验室标准化委员会 (NCCLS) 2010年标准判定敏感性，分为敏感(S)、中敏(I)和耐药(R)。

2 结果与分析

2.1 分离菌株的培养特性及镜检结果

分离纯化的菌株，经过24 h的RV沙门菌增菌液培养后菌液由原本的透明深蓝色变浅蓝色浑浊，管底有灰白色沉淀。麦康凯琼脂培养基(MAC)上为无色半透明、光滑、边缘整齐的菌落；在 SS 培养基可看到呈露珠样的细小无色透明、圆整、湿润和光滑的菌落，培养基由红色变为黄色；挑取纯化培养后的单个菌落革兰氏染色，显微镜油镜下观察细菌的染色特性，可见细菌呈革兰氏阴性短杆菌。

2.2 生化试验结果

对分离到的6株疑似鸡沙门氏菌分别挑选单菌落进行纯培养后，接种到细菌新型生化鉴定管里进行鉴定。结果由表2可知，三糖铁琼脂试验、赖氨酸脱羧酶、甘露醇试验均为阳性；靛基质试验、尿素试验、氰化钾试验、山梨醇试验、β-半乳糖苷(ONPG)试验均为阴性，符合沙门氏菌属的生化特性。

表2 6株鸡源沙门氏菌生化鉴定结果

2.3 血清型鉴定结果

根据沙门氏菌属O多价A-F群血清、H血清、Vi因子血清鉴定结果，参照沙门氏菌诊断抗原表，确定S1、S2、S3、S4菌株属于D群鸡伤寒沙门氏菌，其抗原式为：O抗原1(+)、9(+)、12(+)，H抗原(-)、(-)；S5、S6菌株属于D群鸡白痢沙门氏菌，其抗原式为：O抗原9(+)、12(+)，H抗原(-)、(-)。

2.4 分离菌多重PCR鉴定结果

由图1可知，提取分离菌基因组 DNA 作为模板，利用沙门氏菌多重混合引物进行PCR扩增，6株分离菌的电泳检测目的条带大小与预期一致。结果显示：S1、S2、S3、S4菌株均扩增出495bp、252bp和174bp大小的3个条带，确定为鸡伤寒沙门氏菌；S5、S6菌株均扩增出495bp和252bp大小的两个条带，确定为鸡白痢沙门氏菌。

2.5 药敏试验结果

利用纸片扩散法对分离出的鸡沙门氏菌进行药敏试验。结果由表3可知，不同菌株对抗生素的敏感性存在一定的差异，多数菌株对强力霉素、红霉素、克林霉素、多粘菌素B、利福平耐药；对新霉素、四环素中度敏感；对氨苄西林、阿莫西林、头孢氨苄、头孢噻肟、头孢他啶、卡那霉素、庆大霉素、 阿米卡星、妥布霉素、氟苯尼考、复方新诺明、呋喃唑酮、左氟沙星敏感。

M：DL2000 DNA Marker；1：S1菌株；2：S2菌株；3：S3菌株；4：S4菌株；5：S5菌株；6:S6菌株。

表3 6株鸡源沙门氏菌药敏试验结果

3 讨论与结论

沙门氏菌病是人畜共患的一种细菌性疾病，血清型较多，感染谱较广，可以在人与动物之间通过直接接触传播[6]。有研究表明，世界上20%的家禽产品受到沙门氏菌的污染，其可以通过生物膜的形成在动物和人类的环境和设施中长期存在[7，8]。有资料统计，在我国70%～80%细菌性食物中毒事件是由沙门氏菌引起的，而引起沙门氏菌中毒的食品中，约90%是肉、蛋、奶等畜产品[9，10]。鸡沙门氏菌感染雏鸡导致拉稀、糊肛等症状，死亡率较高；感染成年鸡常引起腹膜炎、输卵管炎或隐性感染等，可垂直传播，给养鸡业造成极大困扰[11，12]。目前，防控沙门氏菌国内尚无商品化的相关疫苗，主要依靠抗生素药物治疗和不断检疫净化[13]。随着抗生素的不科学、不合理使用，大量细菌产生耐药性，沙门氏菌对抗菌药耐药性也日益严重，耐药范围扩大和耐药水平增高已成为影响全球公共卫生安全的重要问题[14-16]。

本试验通过对大理州疑似鸡沙门氏菌感染的病死鸡进行检测，从肝脏组织中分离出病原菌，根据分离菌株的培养特性、形态特点及生化试验初步判定为沙门氏菌，再通过血清型鉴定及多重PCR鉴定，确定6株分离菌株分属于D群沙门氏菌的鸡伤寒沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌。本研究利用28种抗生素对分离菌株进行药物敏感性测定，发现6株分离菌对这28种抗生素的敏感性存在差异，不同菌株表现出不同的耐药性，多数菌株对强力霉素、红霉素、克林霉素、多粘菌素B、利福平耐药；对新霉素、四环素中度敏感；对氨苄西林、阿莫西林、头孢氨苄、头孢噻肟、头孢他啶、卡那霉素、庆大霉素、 阿米卡星、妥布霉素、氟苯尼考、复方新诺明、呋喃唑酮、左氟沙星敏感。从不同地区、不同鸡场中分离出的沙门氏菌耐药性存在差异，主要原因是不同地区因气候、环境因素不同，鸡沙门氏菌流行菌株不一样，加上各养殖场(户)使用抗生素的种类、使用方法、浓度、次数也不尽相同。因此，临床用药需要因场而异，有能力的养殖场应定期开展细菌药敏监测，筛选高度敏感药物进行治疗，并且制定合理、科学的使用方法。近年来，联合用药是治疗畜禽细菌病的良方，可以对上述筛选出来的敏感药物加以研究，联合用药，避免耐药菌株出现，能有效防治鸡沙门氏菌引起的细菌性疾病。