口腔清洁护理用品 牙膏中绿原酸含量的测定 高效液相色谱法

前言

本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件的内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由中国口腔清洁护理用品工业协会提出。

本文件由全国口腔护理用品标准化技术委员会牙膏分技术委员会(SAC/TC492/SC1)归口。

本文件主要起草单位：无限极(中国)有限公司、柳州两面针股份有限公司、重庆登康口腔护理用品股份有限公司、广州质量监督检测研究院。

本文件主要起草人：高艳、陈杰锋、肖蕾、黄华来、管弋铦、夏泽敏。

本文件为首次发布。

1 范围

本文件规定了采用高效液相色谱法测定口腔清洁护理用品牙膏中绿原酸含量，包括试剂和材料、仪器和设备、分析步骤、结果计算、检出限和定量限、允许差。

本文件适用于碳酸钙基质、二氧化硅基质、磷酸氢钙基质牙膏中绿原酸含量的测定。

2 规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法

3 术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4 试剂和材料

除非另有规定，所有试剂均为分析纯。水为符合GB/T 6682中规定的一级水。

4.1 乙腈:色谱纯。

4.2 甲醇:色谱纯。

4.3 磷酸:优级纯。

4.4 50%(体积分数)甲醇水溶液。

4.6 甲醇-磷酸混合溶液：甲醇(4.2)+磷酸(4.3)+水=50+2+48(体积比)。

4.7 绿原酸标准品：纯度≥95%，CAS号、分子式、相对分子质量和结构式参见附录A表A.1。

4.8 绿原酸标准储备溶液1

称取绿原酸标准品(4.7)10mg(精确至0.01mg，纯度修正)于50mL棕色容量瓶中，用50%甲醇水溶液(4.4)溶解并定容至刻度，此溶液浓度为0.20mg/mL。该溶液于棕色瓶中在0℃～4℃冰箱避光可保存30天。

4.9 绿原酸标准储备溶液2

吸取0.20mg/mL绿原酸标准储备溶液1(4.8)5.0mL于100mL棕色容量瓶中，用50%甲醇水溶液(4.4)定容至刻度，此溶液浓度为10.00μg/mL。该溶液于棕色瓶中在0℃～4℃冰箱避光可保存7天。

4.10 绿原酸标准工作溶液

分别吸取10.00μg/mL 绿原酸标准储备溶液2(4.9)0.3mL、0.5mL、1.0mL、2.0ml、5.0mL于10mL棕色容量瓶中，再用50%甲醇水溶液(4.4)稀释至刻度，配制成浓度为0.30μg/mL、0.50μg/mL、1.00μg/mL、2.00μg/mL、5.00μg/mL标准工作溶液。现配现用。

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4.11 石英砂

40～80目，含量≥99.0%。

5 仪器和设备

5.1 高效液相色谱仪：配备二极管阵列(或紫外)检测器。

5.2 分析天平：感量为0.1mg、 0.01mg。

5.3 棕色容量瓶：10mL、 50mL、 250mL。

5.4 具塞刻度离心管：50mL。

5.5 超声波仪:功率不小于300W。

5.6 离心机：转速不小于5000r/min。

5.7 微孔滤膜：孔径0.22μm。

5.8 涡旋振荡器：功率不小于15W。

5.9 移液管或移液器：1mL、 2mL、 5mL。

6 分析步骤

6.1 试样处理

称取试样1g(精确至0.1mg)于具塞刻度离心管(5.4)中，加入约1g石英砂(4.11)，再准确加入甲醇-磷酸混合溶液(4.6)20mL，称定重量，涡旋振荡2min， 35℃水浴中超声提取30min，冷却至室温后用甲醇-磷酸混合溶液(4.6)补足损失重量， 5000r/min离心分离10min，取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，滤液作为试样溶液上机待测。

6.2 测定条件

高效液相色谱测定参考条件如下：

a)色谱柱规格：C18色谱柱：250mm × 4.6mm(粒径5μm)，或等效色谱柱；

b)流动相：A 乙腈(4.1)，B 0.1%磷酸溶液(4.5)，梯度洗脱，见表1；

表1 流动相梯度洗脱表

c)流量：1.0mL/min；

d)柱温：30℃；

e)进样量：20μL；

f)检测波长：327nm。

6.3 标准工作曲线绘制

按6.2色谱条件检测，以绿原酸标准工作溶液(4.10)的浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，进行线性回归得到标准曲线方程。

绿原酸标准品的色谱图参见附录B中的图B.1。

6.4 测定

按6.2的色谱条件，取6.1步骤中的待测试样溶液进样，得到试样溶液的峰面积，根据保留时间和二极管阵列的光谱图定性，绿原酸标准品的DAD光谱图参见附录B中的图B.2。从标准曲线上查得试样溶液中绿原酸的含量。

试样溶液中绿原酸的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应将提取液稀释后测定或增加提取溶液的浓度重新检测。

6.5 空白试验

除不称取试样外，均按上述步骤进行。

6.6 平行试验

样品中的绿原酸含量应根据两次独立的平行试验结果的算术平均值确定。

7 结果计算

试样中的绿原酸含量按公式(1)计算：

(1)

式中：

X——试样中绿原酸的含量，单位为毫克每千克(mg/kg)；

c——从标准曲线中得出的绿原酸浓度(扣除空白值)，单位为微克每毫升(μg/mL)；

V——试样溶液的体积，单位为毫升(mL)；

m——试样质量，单位为克(g)。

计算结果保留3位有效数字。

8 检出限和定量限

当样品称样量为1g，混合溶液加入量为20mL时，本方法绿原酸的检出限为0.52mg/kg，定量限为1.04mg/kg。

9 允许差

在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的10%。

附录A

(资料性)

绿原酸的CAS号、分子式、相对分子质量和结构式

绿原酸的CAS号、分子式、相对分子质量和结构式，见表A.1。

表A.1 绿原酸的CAS号、分子式、相对分子质量和结构式

附录B

(资料性)

参考谱图

绿原酸酸标准品的参考色谱图和光谱图，见图B.1和图B.2。

注：绿原酸参考保留时间6.7min。

图B.2 绿原酸标准品的DAD光谱图