高效液相色谱法测定和血明目片中龙胆苦苷、木犀草苷和黄芩苷含量

安艳苏，毕秋左，张顺平

曲靖市食品药品检验检测中心，云南 曲靖 655000

和血明目片是收载于《中国药典》的处方药，由蒲黄、丹参、地黄、墨旱莲、菊花、黄芩、龙胆等十九味中药组成，主要功能凉血止血、滋阴化瘀、养肝明目，可用于阴虚肝旺，热伤经脉所引起的眼底出血［1］。龙胆中的龙胆苦苷具有抗炎、抗癌、利胆等作用［2-4］。黄芩含多种黄酮类化合物，主要有黄芩苷、黄芩素等，具有抑菌、利尿、抗炎、抗变态及解痉作用［5-8］。菊花中的木犀草苷具有祛痰、止咳、平喘的作用［9-10］。本文采用高效液相色谱法同时测定和血明目片中的龙胆苦苷、木犀草苷、黄芩苷的含量。方法专属性强、操作简便、稳定、结果准确，适用于和血明目片产品的质量控制。

1 仪器与试药

1.1 仪器

1260 型高效液相色谱仪（美国Agilent 公司，包括G7129A 型四元泵、G7115A 型自动进样器及柱温箱和G7162A 型紫外检测器）；MS205DU 电子分析天平（上海梅特勒仪器有限公司）；AS-B 系列超声波清洗器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司，功率为500 W，频率为40 kHz）。色谱柱：Hypersil ODS2 C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）(大连依利特分析仪器有限公司，柱号：E2816705，批号：15112)。

1.2 试药

龙胆苦苷对照品（批号110770-201515，含量100.0%）；木犀草苷对照品（批号111720-201408，含量94.9%）；黄芩苷对照品（批号110715-201720，含量93.5%）均购于中国食品药品检定研究院。甲醇（分析纯，成都市科隆化学品有限公司，批号2021072001）；乙腈（色谱纯，德国默克有限公司，批号72-2440）；水为超纯水。和血明目片（国药准字Z20073062，规格：0.31 g）均购自西安碑林药业股份有限公司（批号：PA221010021、PA220060501、PA220060402）。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液制备

取样品适量，研细，取0.6 g，精密称定，置于50 mL 容量瓶中，加入甲醇适量，超声处理（功率240 W，频率45 kHz）30 min，放冷至室温，用甲醇定容至刻度，摇匀，过0.45 μm 微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.2 阴性样品溶液制备

按照和血明目片处方比例及工艺方法分别制备不含龙胆、菊花、黄芩的阴性样品，并按“2.1”项下方法，制成阴性样品溶液。

2.3 混合对照品溶液的制备

2.3.1 龙胆苦苷、黄芩苷混合对照品的制备 精密称取龙胆苦苷对照品10.05 mg，黄芩苷对照品14.22 mg于同一25 mL 容量瓶中，加适量甲醇充分溶解，甲醇定容，摇匀，即得。

2.3.2 木犀草苷对照品的制备 精密称取木犀草苷对照品10.80 mg 于50 mL 容量瓶中，加适量甲醇充分溶解，甲醇定容，摇匀，即得。

2.3.3 混合对照品溶液的制备 分别精密吸取“2.3.1”项下的混合对照品5 mL，“2.3.2”项下的对照品4 mL 于同一25 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，即得龙胆苦苷80.40 μg/mL，木犀草苷32.80 μg/mL，黄芩苷106.37 μg/mL 的混合对照品溶液。

2.4 色谱条件

色谱柱：Hypersil ODS2 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.1%磷酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～7 min，90% A；7～11 min，90%→87% A；11～20 min，87%→82% A；20～43 min，82%→80% A；43～44 min，80% →50% A；44～50 min，50% A；50～51 min，50%→90% A；51～55 min，90% A）；柱温：30 ℃；流速：1 mL/min；检测波长：254 nm；进样量：10 μL。

2.5 系统适用性试验及专属性考察

按照“2.4”项下色谱条件下，取阴性样品溶液、混合对照品溶液与供试品溶液各10 μL 进样，记录色谱图。龙胆苦苷、木犀草苷、黄芩苷的保留时间依次为11.7 min、25.4 min、42.4 min；理论板数依次为12 535、85 439、51 314；3 个成分均完全分离，阴性样品溶液在与混合对照品溶液相应保留时间处未出现色谱峰，说明和血明目片中的其他成份对测定无干扰，见图1。

图1 HPLC色谱图：A.混合对照品；B.样品；C.龙胆阴性样品；D.菊花阴性样品；E.黄芩阴性样品

2.6 线性关系考察

精密吸取“2.3”项下混合对照品溶液适量，分别稀释成5 个不同浓度的混合对照品系列，按“2.4”项下色谱条件进行测定，以进样浓度X 为横坐标，峰面积Y 为纵坐标，进行线性回归，计算回归方程，结果见表1。

表1 3种成分的线性回归方程

2.7 重复性试验

取已知含量的和血明目片样品（批号PA22101 0021），分别按照“2.1”项下方法制备6 份供试品溶液，按“2.4”项下的方法测定其含量，结果龙胆苦苷、木犀草苷、黄芩苷3 种成分的含量的RSD 值分别为2.21%、1.42%、1.82%，结果表明该方法重复性良好。

2.8 稳定性试验

取同一供试品溶液，室温下分别于0、8、16、24、30 h 进样测定，考察龙胆苦苷、木犀草苷、黄芩苷在室温下溶液的稳定性，记录色谱图，以峰面积进行计算，结果RSD 分别为1.21%、0.89%、1.05%。结果表明供试品溶液在室温下30 h 内稳定。

2.9 加样回收率试验

取6 份已知含量的样品（批号PA221010021），每份约0.3 g，精密称定，分别精密加入“2.3.1”项下的混合对照品2.5 mL、“2.3.2”项下的对照品0.5 mL，按“2.1”项下的方法制备加样回收样品溶液，按“2.4”项下的色谱条件进样，计算加样回收率，结果见表2。

表2 3种成分的回收率结果（n=6）

2.10 样品测定

取3 批次和血明目片样品（批号：PA221010021、PA220060501、PA220060402），每批各取3 份，分别按“2.1”项下方法制得供试品溶液，按“2.4”项下色谱条件进行测定，按“2.6”项下回归方程计算各成分的含量，结果见表3。

表3 样品含量测定结果（mg/g，n=3）

3 讨论

3.1 样品提取条件的优化

和血明目片由十九味中药材组成，化学成分比较复杂，供试品的制备通过参考相关文献［5-10］，以超声提取为基础，依次考察了甲醇、乙醇、50%甲醇和50%乙醇作为提取溶剂，提取时间考察了20 min、30 min、45 min、60 min，结果显示以乙醇为溶剂时，龙胆苦苷和木犀草甘峰形不太好，用甲醇和50%甲醇提取时，甲醇提取效率较高，30 min 内能提取完全，并且各成分分离度较好，峰形理想，因此本试验最终选择了50 mL 甲醇超声提取30 min，作为最终的提取方法。

3.2 波长的选择

本方法选用DAD 检测器在200～400 nm 波长处，分别扫描龙胆苦苷、木犀草甘、黄芩苷对照品溶液和供试品溶液，结果表明3 个主要成分的最大吸收波长均不相同，在254 nm 波长条件下，HPLC 图谱中色谱峰峰形和峰强度均较为理想，故本试验最终选择254 nm 作为检测波长。

3.3 流动相的考察

对不同流动相组成及比例进行考察，发现在流动相中加入一定比例的酸有助于提高待测成分与杂质峰之间的分离度，且峰形好，经过进一步考察，确定用乙腈-0.1%磷酸溶液作为流动相系统进行梯度洗脱，可以获得理想的色谱图。

4 总结

本试验建立高效液相色谱法同时测定和血明目片中龙胆苦苷、木犀草苷、黄芩苷的方法。现行和血明目片标准含量测定仅以丹参素作为指标成分，本试验所建立的含量测定方法能对3 味主药（龙胆、菊花、黄芩）的含量同时进行控制，该方法前处理方法简便、快捷，梯度洗脱方法灵敏、准确，测定结果稳定、可靠，重复性好，适用性强，样品的分离度较好，阴性样品无干扰，能够为和血明目片的质量控制提供更准确、更全面的参考依据。