高效液相色谱法测定食品中山梨酸、苯甲酸、糖精钠的基质干扰分析及定性确证

丁 梅

（梅河口市食品药品检验检测中心，吉林 梅河口 135000）

苯甲酸、山梨酸、糖精钠是食品中应用最广泛、最常见的食品添加剂，在《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）[1]中明确规定了其使用范围和限量，被国家食品安全监管部门列为重点监测的检测项目。目前食品中苯甲酸、山梨酸、糖精钠测定方法有液相色谱法[2-8]和气相色谱法[8-10]和超高效液相色谱串联质谱法[11]，其中高效液相色谱法因检验成本低、前处理简单、设备通用性和普及性好而成为主要检测方法之一。目前色谱分析主要是以保留时间进行定性，对于基质复杂的样品，相同保留时间段常有基质干扰峰出现，尤其是以一种流动相洗脱下的保留时间进行定性往往会出现假阳性样品。本文根据目标物的出峰时间会随着流动相pH 值的不同而发生改变这一现象[12-13]，研究以乙酸铵溶液+甲醇（95+5）为流动相出现可疑峰时，再以（甲酸-乙酸铵溶液）+甲醇（92+8）为流动相分析可疑峰，通过不同pH 的两种流动相洗脱下的保留时间进行综合定性分析，可以有效避免由样品基质干扰出现假阳性样品，在实际检测工作中效果 较好。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

LC20AT 高效液相色谱仪（配紫外检测器，日本岛津公司）；重载数显型涡旋混合器（美国Talboys公司）；KQ-500DE 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；KH20R-Ⅱ高速冷冻离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）。

甲醇、甲酸（色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司）；标准物质苯甲酸、山梨酸、糖精钠（德国Dr.Ehrenstorfer 公司）。

20 mmol·L-1乙酸铵溶液：称取1.54 g 优级纯乙酸铵（Alfa Aesar），加1 000 mL 水溶解，过0.22 μm滤膜后备用。

甲酸-乙酸铵溶液（2 mmol·L-1甲酸-20 mmol·L-1乙酸铵）：在1 000 mL 乙酸铵溶液（20 mmol·L-1）中加入75.2 μL 甲酸，混合后过0.22 μm 滤膜后备用。

1.2 色谱条件

色 谱 柱：Shimpack VP-ODS（5 μm，250 mm× 4.6 mm）；检测波长：230 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μL；流速：1.0 mL·min-1；流动相1：20 mmol·L-1乙酸铵溶液+甲醇（95+5）；流动相2：甲酸-乙酸铵溶液（2 mmol·L-1甲酸-20 mmol·L-1乙酸铵）+甲醇（92+8）。

1.3 标准溶液配制

苯甲酸、山梨酸、糖精钠标准储备溶液：分别准确称取标准物质各0.01 g 于10 mL 容量瓶中，分别用甲醇溶解并定容，配制的储备液浓度均为 1 mg·mL-1。

苯甲酸、山梨酸、糖精钠混合标准溶液：分别准确吸取苯甲酸、山梨酸、糖精钠标准储备溶液适量，用超纯水逐级稀释配制混合标准溶液，其浓度为 5 μg·mL-1。

1.4 样品处理

称取样品2 g（精确至0.001 g）于50 mL 具塞刻度试管中，加入25 mL 水，涡旋1 min，超声30 min，加亚铁氰化钾溶液和乙酸锌溶液各2 mL，混匀，加水定容至刻度，静置30 min。取适量上清液于 10 000 r·min-1离心5 min，过0.22 μm 滤膜备用。

1.5 定性分析

以乙酸铵溶液+甲醇（95+5）为流动相，分别进样混标液和样液，经色谱柱分离后以保留时间定性，若出现可疑色谱峰时，再以甲酸-乙酸铵溶液+甲醇（92+8）为流动相分析可疑峰，采用两种流动相洗脱下的保留时间进行综合定性分析，进一步定性验证样品中可疑色谱峰是否为目标峰。

2 结果与分析

2.1 以乙酸铵溶液+甲醇为流动相的检测结果

随机选取市售肉千子、蛋糕、冷面、红方样品，经前处理后，以乙酸铵溶液+甲醇（95+5）为流动相（流动相1）进行色谱分析，并与混合标准溶液色谱图进行比较。以保留时间定性可知，肉千子中检出山梨酸，未检出苯甲酸、糖精钠（图1）；蛋糕中检出糖精钠，未检出苯甲酸、山梨酸（图2）；冷面中检出山梨酸，未检出苯甲酸、糖精钠（图3）；红方中检出苯甲酸，未检出山梨酸、糖精钠（图4）。

图1 肉千子样品和混合标准溶液色谱图（流动相1）

图2 蛋糕样品和混合标准溶液色谱图（流动相1）

图3 冷面样品和混合标准溶液色谱图（流动相1）

图4 红方样品和混合标准溶液色谱图（流动相1）

2.2 以甲酸-乙酸铵溶液+甲醇为流动相的定性确证

将上述肉千子、蛋糕、冷面、红方样品，以甲酸-乙酸铵溶液+甲醇（92+8）为流动相（流动相2）进行色谱分析，并与混合标准溶液色谱图进行比较。以保留时间定性可知，肉千子中未检出苯甲酸、山梨酸、糖精钠（图5）；蛋糕中未检出苯甲酸、山梨酸、糖精钠（图6）；冷面中检测出山梨酸，未检出苯甲酸、糖精钠（图7）；红方中未检出苯甲酸、山梨酸、糖精钠（图8）。由两种流动相保留时间综合定性分析得出，肉千子中山梨酸为假阳性，蛋糕中糖精钠为假阳性，冷面中山梨酸为阳性，红方中苯甲酸为假阳性。

图5 肉千子样品和混合标准溶液色谱图（流动相2）

图7 冷面样品和混合标准溶液色谱图（流动相2）

2.3 样品检测结果

随机选取市售样品基质相对复杂的15 种样品进行苯甲酸、山梨酸、糖精钠测定，分别以两种流动相洗脱进行色谱分析，定性结果见表1。以乙酸铵溶液+甲醇（95+5）为流动相时，15 种样品中均检测出食品添加剂；以甲酸-乙酸铵溶液+甲醇（92+8）为流动相时，15 种阳性样品中有12 种样品为假阳性，假阳性率80%。这是由于基质复杂样品仅以一种流动相的保留时间进行定性时，容易出现假阳性样品，而以两种流动相保留时间综合定性验证，才能使样品检测结果更加准确可靠。

表1 样品中山梨酸、苯甲酸、糖精钠定性确证结果

图8 红方样品和混合标准溶液色谱图（流动相2）

3 结论

本研究应用高效液相色谱法测定基质复杂样品中的山梨酸、苯甲酸、糖精钠，采用不同pH 的两种流动相洗脱下的保留时间进行综合定性分析，可有效避免由样品基质干扰出现的假阳性样品的情况。该方法在实际工作中得到了较好的应用，发挥了有效的作用。