改进QuEChERS-气相色谱-三重四级杆质谱法测定水果中吗啉脂肪酸盐的残留

陈锂，朱正伟，汪薇，荣茂，江丰，王会霞

（湖北省食品质量安全监督检验研究院，湖北省食品质量安全检测工程技术研究中心，湖北武汉 430075）

吗啉脂肪酸盐果蜡由吗啉、脂肪酸和天然动植物蜡（如棕榈蜡）或天然动植物胶（如紫胶），在一定温度下反应制成。自12到13世纪起被广泛使用于水果和蔬菜表面，用于防止水分的挥发、抑制昆虫的侵染和抗菌[1,2]，以达到长期存储和运输的目的。目前市场上的水果特别是柑橘、梨和苹果会被喷洒上人工生产的吗啉脂肪酸盐果蜡，人体误食后会在体内分解成吗啉和相应的脂肪酸。有动物机体实验表明，吗啉在一定剂量下摄入可以引起动物肝脏、肾脏损伤；由于环境和食物中亚硝酸盐的存在，吗啉还可以在适当的条件下发生亚硝基化反应生成亚硝基吗啉，亚硝基吗啉对所有受试动物均有致癌性[3,4]，属于WHO规定的2B类致癌物[5]。欧盟在食品添加剂法规中，早已禁止销售含有吗啉的食物；加拿大卫生部门建议吗啉类物质的每日允许摄入量（ADI）不超过0.48 mg/kg bw·d[6]；而在中国吗啉脂肪酸盐果蜡被允许按照产品要求适当添加使用，因此检测水果中吗啉脂肪酸盐果蜡具有极其重要的意义。

目前，国家标准GB 1886.227-2016《食品添加剂吗啉脂肪酸盐果蜡》只对果蜡的理化指标进行规定和检测，对其含量的检测方法并未给出。文献中的方法也主要集中于吗啉的直接提取和检测[7,8]，检测方法有液相法、液相色谱串联质谱法、气相色谱法和气相色谱-质谱法等[9-11]，由于吗啉分子量较小，在仪器分析中出峰时间较早且峰型较差，在复杂的食品基质中存在很大的干扰问题。同时，由于生产吗啉脂肪酸盐果蜡使用的脂肪酸和天然动植物蜡种类繁多，市面上的吗啉脂肪酸盐果蜡各不相同，难以对其进行准确的定性和定量，吗啉脂肪酸盐果蜡的检测方法未见报道。

为提高食品样品中目标化合物检测结果的准确性并降低基质干扰等问题，样品的前处理技术十分重要。QuEChERS方法被广泛的应用于食品前处理步骤中[12]，目前有两种官方的前处理方法，分别是AOAC（Association of Official Agricultural Chemists）推荐使用的乙酸盐作为缓冲剂的方法[13]和CEN（European Committee for Standardization）使用的柠檬酸盐作为缓冲剂的方法[14]，其前处理方法都是使用提取试剂对目标化合物进行提取后分层，有机相通过不同吸附剂进行纯化达到去除食物基质中色素、脂肪和蛋白质等干扰物的目的[15,16]。本研究根据吗啉脂肪酸盐果蜡的基本性质，经QuEChERS方法提取、净化后，通过衍生的方法将水果中的吗啉脂肪酸盐果蜡转换成亚硝基吗啉（N-nitrosomorpholine，NMOR），使用气相色谱-串联质谱分析样品，以基质标准曲线定量，建立QuEChERS-GC-MS/MS法检测水果中吗啉脂肪酸盐果蜡的残留，为实现水果中吗啉脂肪酸盐果蜡的监测提供理论依据。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

TSQ 9000 GC-MS/MS气相色谱-三重四极杆质谱仪，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；Avanti JXN-30高速离心机，美国贝克曼公司；ME 2002 E型分析天平，梅特勒-托利多仪器上海有限公司；XH-C涡旋混合器，江苏金怡仪器科技公司；N-EVAP 24氮吹仪，美国Organomation公司。

水果购于超市和农贸市场；乙腈、正己烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙醚、二氯甲烷，均为色谱纯，德国默克公司；弗罗里硅土填料（Florisil）40～60 µm、十八烷基键合硅胶填料（C18）40～60 µm、N-丙基乙二胺（N-propylethylenediamine，PSA）40～60 µm、石墨化炭黑吸附剂（GCB）40～60 µm，北京迪马科技有限公司；吗啉、N-亚硝基吗啉（NMOR），Toronto Research Chemicals；盐酸、亚硝酸钠、无水硫酸镁（MgSO4），国药集团化学试剂有限公司。

1.2 标准溶液的配制

标准储备溶液（10 µg/mL）：分别准确称取1.0 mg（精确至0.0001 mg）吗啉和亚硝基吗啉标准品，用色谱纯乙腈溶解并定容至100 mL，避光-18 ℃保存备用。

1.3 样品前处理

分别取全果、果皮和果肉，切碎放入搅碎机中制备成匀浆，准确移取10.0 g至50 mL离心管中，加入1%酸化（甲酸）乙腈10 mL，1 g氯化钠，1颗陶瓷均质子，剧烈涡旋1 min，以4000 r/min离心3 min；取上清液7 mL，加入PSA 300 mg、GCB 300 mg，涡旋1 min；取上清液5 mL，加入2.5 mL 200 g/L HCl和2.5 mL 300 g/L NaNO240 ℃超声10 min，冰浴3 h，期间每30 min涡旋一次，每次1 min，衍生完成后加入1 g NaCl，以4000 r/min离心3 min，取上清液2.5 mL至试管中，40 ℃水浴中氮吹至近干，加入1 mL乙腈定容，过0.22 µm有机相滤膜，气相色谱-三重四极杆质谱测定分析。

1.4 基质标准曲线的制备

分别称取不含目标物的空白水果样品10.0 g，按1.3节方法进行预处理。用基质提取液稀释标准溶液，以峰面积（Y）为纵坐标对各被测组分的质量浓度（X，μg/mL）为横坐标作图，绘制基质标准曲线。

1.5 仪器条件

色谱条件：色谱柱：HP-FFAP毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升温程序：40 ℃保持1 min；以15 ℃/min升温至120 ℃保持1 min；以30 ℃/min升温至240 ℃保持5 min，总时长16 min；进样口温度280 ℃，流速1.3 mL/min；进样量1.0 μL；进样方式：不分流进样。

质谱条件：EI源；电离能量70 eV，离子源温度280 ℃，传输线温度280 ℃，溶剂延迟3.5 min，多反应监测模式，其具体参数见表1，色谱图见图1。

表1 亚硝基吗啉的质谱分析参数Table 1 The mass spectrometry conditions of N-nitrosomorpholine

1.6 数据处理

相关质谱数据由仪器中的Xcalibur分析软件收集，Quan Browser定量软件分析数据。数据汇总后，经Office软件进行数据处理。

2 结果与讨论

2.1 提取试剂的选择

乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、1%甲酸-乙腈、乙醚是QuEChERS方法中常见的萃取溶剂[17]，提取试剂的选择可以有效的降低基质效应，减少共萃取物，提高后续净化和衍生步骤的效果。前期实验表明，水果中水分含量较大，加入无水硫酸镁会迅速结块并放热降低目标化合物的提取率，因此实验中不加入无水硫酸镁，使用陶瓷均质子达到分散基质的效果。本实验以阳性柑橘为研究对象，通过衍生后亚硝基吗啉峰面积比较六种常用有机试剂（见图2）对吗啉脂肪酸盐果蜡的提取效果。

结果表明，乙酸乙酯的提取效果最差，二氯甲烷的提取效果最好，但是会引入更多的杂质对目标化合物进行干扰，由于二氯甲烷不溶解于水，在第二步衍生过程中亚硝基化反应在两相中进行，导致衍生化效果不稳定，实验准确度偏差大于20%，不符合GB 27404-2008实验室质量控制规范要求。1%甲酸-乙腈混溶于水提取效果较好，目标化合物在酸性条件下衍生稳定，因此选用1%酸化乙腈作为提取试剂。

2.2 净化填料的优化

由于果汁基质含有较高的维生素、色素和糖分对后续衍生有较大的影响[18]，为保证提取效率的同时排除基质干扰，本实验以阳性柑橘为研究对象，通过衍生后亚硝基吗啉峰面积进行比较，对净化填料和用量进行选择并优化。实验比较了单因素条件下PSA、C18、Florisil、GCB不同使用量对目标化合物提取的影响（图3）。结果表明，PSA和GCB可以有效的去除柑橘中不同杂质对吗啉脂肪酸盐的影响，目标化合物峰面积随着用量的增加而提高，在300 mg时净化效果最优，继续增加净化填料用量会吸附目标化合物并对提取产生影响；C18在50 mg时效果最优，随着用量的增加峰面积逐渐降低；Florsil对目标化合物影响较大不适于吗啉脂肪酸盐果蜡的净化。由于柑橘中色素较多，单独使用PSA虽然净化效果较好，但是净化液依然带有颜色，而使用GCB净化后为无色溶液。为进一步筛选净化填料，将最优条件下的PSA、GCB和C18分别进行混合同单独使用PSA净化效果进行比较（如图3，mixed-mode）。结果表明，PSA和GCB混合使用的效果最优（MS-A），色素的存在对后续衍生存在一定的干扰，C18的加入对目标化合物有一定的影响。因此，选用300 mg PSA和300 mg GCB作为净化剂填料。

2.3 衍生效果的优化

吗啉脂肪酸盐果蜡是由吗啉、脂肪酸和天然动植物蜡（如棕榈蜡）或天然动植物胶（如紫胶），在一定温度下反应制成的食品添加剂。由于吗啉含有仲胺基团，仲胺在酸性条件下可以和亚硝酸钠、亚硝酸盐水溶液或氮氧化物（如N2O3、N2O4、N2OX）发生亚硝基化反应生成N-亚硝胺（NAms）[19-21]。因此，根据吗啉这个特点，实验发现即使在常温条件下，不论吗啉脂肪酸盐果蜡取代基团是什么，吗啉脂肪酸盐果蜡都可以发生亚硝基化反应生成亚硝基吗啉，反应如图4所示。本实验分别讨论了盐酸和亚硝酸钠浓度、反应温度和时间对衍生效果的影响，使用阳性鲜榨桔汁为样本，通过峰面积进行比较。由图5盐酸和亚硝酸钠浓度从0 g/L到800 g/L的正交试验可知，盐酸在200 g/L浓度下和亚硝酸钠300 g/L进行混合衍生效果最优，随着浓度的增加衍生效果逐渐降低，通过测量衍生pH发现，酸性条件下有利于亚硝基化反应，最优pH约为3.3左右，当亚硝酸钠过量时，衍生环境变成强碱性，对反应成抑制效果。

食品基质中的亚硝基化反应速率会受到许多因素的干扰，如维生素C对反应有抑制作用，会延长反应时间[18]。为减少食品基质对衍生化反应的影响，本实验探究了不同反应时间和温度下的反应效率。如图6所示，随着时间的延长峰面积逐渐提高，温度越高亚硝基化反应的速率越慢。当实验样本置于冰箱冷冻层温度设置为-25 ℃时，提取溶剂乙腈会从水相中分离出来从而降低反应速率。因此，最佳的反应温度为0 ℃反应时间为3 h。

2.4 检出限、定量限和基质效应的考察

由于吗啉脂肪酸盐果蜡种类各不相同，但衍生主要发生在其母体吗啉环上，都是将吗啉转变成亚硝基吗啉，所以使用吗啉标准储备液制备1、10、50、100、200、400、800 μg/L 7个不同水平的标准溶液。加入10 mL 1%酸化乙腈，2.5 mL 300 g/L HCl和2.5 mL 200 g/L NaNO240 ℃超声10 min，冰浴衍生3 h，期间每30 min涡旋一次，每次1 min，衍生完成后加入1 g NaCl，以4000 r/min离心3 min，取上清液2.5 mL至试管中，40 ℃水浴中氮吹至近干，加入1 mL乙腈定容，过0.22 μm有机相滤膜。

在最优气相色谱串联质谱条件下，通过质量浓度为横坐标和目标化合物的峰面积为纵坐标制作标准曲线，得到相应的回归方程及其相关系数。对市售水果样品同水平加标，通过1.3前处理后经气相色谱串联质谱检测，外标法定量绘制基质标准曲线。基质效应ME（Matrix effect）以基质匹配标准曲线与纯空白溶剂标曲斜率之比来确定；最低检出限（limit of detection，LOD）由3倍信噪比得出（S/N=3）；最低定量限（limit of quantification，LOQ）由10倍信噪比得出（S/N=10）。

分别比较了柑橘、梨和苹果三种水果全果、果皮和果肉的基质效应，由表2可知，基质效应结果范围在-28.9到-80.6之间，所有结果均超过基质效应可接受的标准（±20%），基质效应明显，水果果肉比果皮表现出了更强的基质效应，因此在实际检测中为保证结果准确，采用基质匹配标准曲线对化合物进行定量分析。衍生后的亚硝基吗啉在1～800 μg/L范围内呈良好的线性关系，其线性相关系数（R2）均大于0.99，亚硝基吗啉检出限在0.14～1.09 μg/kg之间，定量限在0.47～3.63 μg/kg之间，该方法可以满足复杂基质中痕量物质的检测。

表2 亚硝基吗啉的线性方程、基质效应、检出限和定量限Table 2 Analytical performance of the proposed method for NMOR

2.5 回收率和日内精密度实验结果

空白水果样品中准确加入吗啉标准溶液，使添加量分别为4、8、40 μg/kg，按最优条件进行测定，方法的准确度用回收率表示，每个添加水平重复测定6次。方法的日内精密度用6次平行测定的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）表示。由表3可知，衍生后的亚硝基吗啉在不同水果中的加标回收率范围为73.6%～118.5%，RSD为3.6%～15.2%（n=6）。

表3 吗啉的添加回收率和RSDTable 3 Average recoveries (n=6) and relative standard deviations (RSD) at three spiking levels

2.6 实际样品分析

采用优化建立的GC-MS/MS分析方法应用于果皮、果肉和整个水果的分析，选择表面光滑、光亮的水果样品作为实际监测样品。衍生化后苹果和梨果肉中NMOR含量较低或未检出，吗啉脂肪酸盐果蜡主要覆盖在水果表面。全柑橘、柑橘皮、柑橘肉、全苹果、苹果皮、全梨和梨皮的NMOR水平分别为95～712、20～366、10～90、98～263、18～132、110～291、20～143µg/kg。柑橘、梨和苹果中吗啉脂肪酸盐果蜡的检出率分别为78.5%、42.8%、35.7%。这些结果表明，水果中存在吗啉脂肪酸盐果蜡的残留污染，其中柑橘类风险最高。实际样本结果表明，本方法灵敏度高，方法简单，在实际样本中有较高的检出率，适用于日常水果中吗啉脂肪酸盐果蜡的检测和分析。

3 结论

由于生产加工工艺的不同，市面上的吗啉脂肪酸盐果蜡存在多种不同的形式，在检验过程中难以对其进行定性和定量。目前水果表面的检测方法主要是对吗啉的检测，具有一定的局限性，无法准确的代表吗啉脂肪酸盐果蜡。本实验根据吗啉脂肪酸盐果蜡的性质，通过亚硝基化反应将吗啉脂肪酸盐果蜡转变成稳定的亚硝基吗啉进行监测，使用改进QuEChERS作为前处理方法，对提取试剂、净化剂种类和用量进行选择和优化，建立了QuEChERS-GC-MS/MS法测定水果中吗啉脂肪酸盐果蜡的检测方法。采用1%甲酸-乙腈为提取溶剂，QuEChERS净化处理，5.5 mol/L盐酸和4.3 mol/L亚硝酸钠进行衍生，实现了吗啉脂肪酸盐果蜡的定性和定量方法，检出限为0.14～1.09 µg/kg，定量限为0.47～3.63 µg/kg，该方法成功的应用于实际水果的检测，并提供了一种方法简单、灵敏度高、分离效果好的食品基质中吗啉脂肪酸盐果蜡残留检测方法，在理论和实际上都具有重要的意义。