不同层次穴位埋线调节单纯性肥胖大鼠外周脂肪代谢的机制研究*

郑宇皓，申苗衔，伍先明，莫倩，杨硕

（1.贵州中医药大学，贵州贵阳 550025；2.贵州中医药大学第二附属医院，贵州贵阳 550001）

单纯性肥胖是机体由于脂肪堆积过多或分布异常且无明显原发性疾病引起的一种慢性代谢性疾病，与高血压、糖尿病、心脑血管疾病的发病关系密切，并对患者的身心健康造成严重影响[1-2]。世界卫生组织统计显示，全球有超过19 亿成年人超重，其中超过6 亿人患有肥胖症[3]。

穴位埋线疗法是针灸疗法的延伸和发展，其操作过程包含了“穴、针、线”的综合疗法，除有针刺和留针效应外，还能延长刺激时间。其原理是在体内埋置可吸收的蛋白线体，通过线体自身的分解、液化、吸收，达到长时效、强刺激的目的。其临床应用日趋广泛，尤其是在治疗单纯性肥胖方面具有潜在优势[4-7]。

瘦素的发现是肥胖研究领域的一个里程碑。瘦素是摄食调控网络中的上游因子，通过降低动物食欲、提高能量代谢效率，增加能量消耗，减少脂肪储存而减轻机体重量[8]。中枢系统中，瘦素受体（leptin receptor, LEP-R）主要分布在下丘脑；而外周系统也有分布[9]。瘦素介导的中枢机制主要为瘦素与下丘脑长型LEP-R 结合后，通过Janus 蛋白络氨酸激酶2（janus kinase 2, JAK2）/信号转导和转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription,STAT3）途径抑制食欲，增加能量消耗，调节体重[10-11]。细胞因子信号抑制蛋白3（suppressor of cytokine signaling, SOCS3）由JAK2/STAT3 通路激活，而SOCS3 高表达又反过来抑制该通路的活性，从而形成瘦素抵抗，导致瘦素不能发挥调节人体食欲与能量代谢的作用，因此SOCS3 是瘦素信号传导中的主要抑制因子[12]。以往研究认为瘦素仅由下丘脑中枢介导，随着在外周多种细胞中发现LEP-R，瘦素的外周直接调节作用逐渐受到广泛关注，如瘦素可通过JAK2/STAT3 信号通路参与促角质形成细胞增殖的跨膜信号传导，从而促进创面的愈合[13]；以及通过血睾屏障作用于JAK2/STAT3 信号通路，调节脂肪细胞代谢并对雄性生殖功能造成损伤[14]；如脂肪细胞中的功能性LEP-R 提示瘦素可能具有外周自分泌调节功能，能直接调节脂肪细胞代谢，包括抑制脂肪合成、诱导脂肪分解及肥胖形成[15]。

本研究在课题组前期研究[16-17]的基础上，进一步探讨不同层次穴位埋线调节单纯性肥胖大鼠外周脂肪代谢的机制，并验证JAK2/STAT3 信号通路参与瘦素外周直接调节作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

1月龄SD 雄性大鼠60 只，体重（100±20）g，购自第三军医大学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK（渝）2017-0002；实验动物使用许可证号：SYXK（黔）2021-0005。饲养于贵州中医药大学实验动物中心，室内温度（20±2）℃，相对湿度50%，12 h 昼/夜循环照明。自由饮食、饮水，普通饲料适应性喂养1 周。

1.2 主要试剂

兔抗大鼠JAK2 单克隆抗体（批号：ab108596）、兔抗大鼠STAT3 单克隆抗体（批号ab68153）、兔抗大鼠SOCS3 多克隆抗体（批号：ab16030）、兔抗大鼠LEP-R 多克隆抗体（批号：ab5593）（美国Abcam公司），AG490（批号：HY-12000/CS-0108，美国MedChemExpress 公司），逆转录试剂盒（批号：RR047A，日本TaKaRa 公司），BCA 蛋白浓度测定试剂盒（批号：500T，北京索莱宝科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 动物模型的复制与分组将60 只SD 雄性大鼠随机分为对照组（A 组）10 只、模型组50 只。对照组予普通饲料喂养，模型组予高脂饲料喂养。28 周后将体重超过对照组大鼠平均体重20%的作为肥胖模型大鼠[18]。采用随机数字表法将模型复制成功的大鼠分为空白组（B 组）、脂肪层埋线组（C组）、肌肉层埋线组（D组）、脂肪层埋线+AG490组（E 组）、肌肉层埋线+AG490 组（F 组），每组10 只。本实验通过贵州中医药大学第二附属医院医学伦理委员会审查（No：2015088）。

1.3.2 取穴取穴参照华兴邦等[19]研制的大鼠穴位图谱：双侧天枢、水道、脾俞、胃俞、三焦俞、中脘。

1.3.3 治疗方法①A、B 组：每周将大鼠固定在自制大鼠固定器上，不予处理。②C、D 组：每周将大鼠固定在自制大鼠固定器上，将3-0 医用外科可吸收羊肠线剪至0.5～2.0 mm 的长度备用。双手消毒后，戴无菌手套及口罩、帽子，用碘伏消毒相应穴位处，持简易埋线针将羊肠线埋入大鼠相应穴位的脂肪层或肌肉层[20]。每周日上午9：00～12：00埋线治疗1 次，4 次为1 疗程。埋线期间，各组大鼠均予普通饲料喂养，自由饮水。③E、F 组：埋线操作同C、D 组，埋线干预期间每天腹腔注射AG490 1 mg/kg[21]。

1.3.4 脂肪组织采集及检测治疗结束后禁食12 h，次日用10%水合氯醛腹腔麻醉后（0.3 ml/100 g）处死大鼠，剥离大鼠体内白色脂肪组织。将脂肪组织分装至无酶EP 管中，置入-80℃冰箱冷冻保存，进行下一步mRNA 和蛋白检测，并严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 23.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组脂肪组织JAK2 mRNA 和蛋白相对表达量比较

A、B、C、D、E、F 组脂肪组织JAK2 mRNA 和蛋白相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=367.628 和246.146，均P=0.000）。进一步两两比较结果：B、E、F 组脂肪组织JAK2 mRNA 和蛋白相对表达量低于A 组（P＜0.05）；C、D 组JAK2 mRNA 和蛋白相对表达量高于B 组（P＜0.05）；E、F 组与B 组脂肪组织JAK2 mRNA 和蛋白相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；D、E、F 组JAK2 mRNA 和蛋白相对表达量低于C 组（P＜0.05）；E、F 组JAK2 mRNA 和蛋白相对表达量低于D 组（P＜0.05）。见表1和图1。

图1 各组脂肪组织JAK2蛋白的表达

表1 各组脂肪组织JAK2 mRNA和蛋白相对表达量比较（n=10，±s）

表1 各组脂肪组织JAK2 mRNA和蛋白相对表达量比较（n=10，±s）

组别A组B组C组D组E组F组F 值P 值JAK2 mRNA 0.92±0.02 0.80±0.02 1.10±0.01 0.98±0.01 0.81±0.04 0.82±0.02 367.628 0.000 JAK2蛋白1.07±0.04 0.75±0.03 0.92±0.02 0.86±0.02 0.76±0.02 0.74±0.01 246.146 0.000

2.2 各组脂肪组织STAT3 mRNA和蛋白相对表达量比较

A、B、C、D、E、F 组脂肪组织STAT3 mRNA和蛋白相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=13.114 和139.538，P=0.000 和0.001）。进一步两两比较结果：B、E、F 组脂肪组织STAT3mRNA 和蛋白相对表达量低于A 组（P＜0.05）；C、D组STAT3 mRNA 和蛋白相对表达量高于B 组（P＜0.05）；E、F 组与B 组脂肪组织STAT3 mRNA 和蛋白相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；D、E、F 组STAT3 mRNA 和蛋白相对表达量低于C 组（P＜0.05）；E、F 组STAT3 mRNA 和蛋白相对表达量低于D 组（P＜0.05）。见表2和图2。

图2 各组脂肪组织STAT3蛋白的表达

表2 各组脂肪组织STAT3 mRNA和蛋白相对表达量比较（n=10，±s）

表2 各组脂肪组织STAT3 mRNA和蛋白相对表达量比较（n=10，±s）

组别A组B组C组D组E组F组F 值P 值STAT3 mRNA 1.00±0.21 0.86±0.03 1.12±0.03 0.97±0.02 0.87±0.02 0.87±0.02 13.114 0.000 STAT3蛋白1.14±0.06 0.76±0.02 1.00±0.06 0.93±0.02 0.80±0.02 0.82±0.03 139.538 0.001

2.3 各组脂肪组织SOCS3 mRNA 和蛋白相对表达量比较

A、B、C、D、E、F 组脂肪组织SOCS3 mRNA 和蛋白相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=45.883 和68.754，P=0.002 和0.001）。进一步两两比较结果：B、C、D、E、F 组脂肪组织SOCS3 mRNA 相对表达量高于A 组（P＜0.05）；B、E、F 组脂肪组织SOCS3 蛋白相对表达量高于A 组（P＜0.05）；C、D 组SOCS3 mRNA 和蛋白相对表达量低于B 组（P＜0.05）；E、F 组与B 组脂肪组织SOCS3 mRNA和蛋白相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；D、E、F 组SOCS3 mRNA 和蛋白相对表达量高于C 组（P＜0.05）；E、F 组SOCS3 mRNA 和蛋白相对表达量高于D 组（P＜0.05）。见表3和图3。

表3 各组脂肪组织SOCS3 mRNA和蛋白相对表达量比较 （n=10，±s）

表3 各组脂肪组织SOCS3 mRNA和蛋白相对表达量比较 （n=10，±s）

组别A组B组C组D组E组F组F 值P 值SOCS3 mRNA 0.83±0.07 1.41±0.02 0.98±0.02 1.14±0.05 1.36±0.12 1.40±0.23 45.883 0.002 SOCS3蛋白0.94±0.04 1.34±0.10 1.03±0.03 1.11±0.04 1.31±0.09 1.30±0.04 68.754 0.001

图3 各组脂肪组织SOCS3蛋白的表达

2.4 各组脂肪组织LEP-R mRNA 和蛋白相对表达量比较

A、B、C、D、E、F组脂肪组织LEP-R mRNA 和蛋白相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=43.842 和39.776，均P=0.001）。进一步两两比较结果：B、E、F 组脂肪组织LEP-R mRNA 相对表达量低于A 组（P＜0.05）；C、D 组脂肪组织LEP-R mRNA 相对表达量高于A 组（P＜0.05）；B、D、E、F 组脂肪组织LEP-R 蛋白相对表达量低于A 组（P＜0.05）；C、D 组LEP-R mRNA 和蛋白相对表达量高于B 组（P＜0.05）；D、E、F 组LEP-R mRNA 和蛋白相对表达量低于C 组（P＜0.05）；E、F 组LEP-R mRNA 和蛋白相对表达量低于D组（P＜0.05）。见表4和图4。

表4 各组脂肪组织LEP-R mRNA和蛋白相对表达量比较 （n=10，±s）

表4 各组脂肪组织LEP-R mRNA和蛋白相对表达量比较 （n=10，±s）

组别A组B组C组D组E组F组F 值P 值LEP-R mRNA 0.93±0.06 0.74±0.07 1.10±0.07 1.00±0.09 0.77±0.07 0.76±0.05 43.842 0.001 LEP-R蛋白0.89±0.04 0.72±0.03 0.85±0.03 0.81±0.03 0.75±0.03 0.79±0.03 39.776 0.001

图4 各组脂肪组织LEP-R蛋白的表达

3 讨论

肥胖与先天体质、饮食、运动等因素有关，涉及脾、肾、胃三脏。脾胃运化功能障碍，肾气蒸腾水液无力，就会导致水谷精微不能输送到全身，则痰湿膏脂就会聚集在体内，从而形成肥胖。本实验选取双侧天枢、水道、脾俞、胃俞、三焦俞、中脘进行穴位埋线治疗，脾俞为脾之背俞穴，有健脾和胃、利湿升清之功；天枢穴为大肠募穴，有和胃气，通调肠胃之功；中脘穴为胃募穴、腑会，具有良性调理胃肠道的功能；水道能通调水道，利尿消肿；胃俞为胃的背俞穴，可理脾和胃；三焦俞为三焦的背俞穴，疏利三焦、化湿行水。诸穴合用，以达健脾和胃、通调水道，化痰除湿之功。

本研究中，脂肪层埋线组及肌肉层埋线组JAK2、STAT3、LEP-R mRNA 和蛋白相对表达量相比空白组、肌肉层埋线+AG490 组、脂肪层埋线+AG490 组均明显升高，并且脂肪层埋线组及肌肉层埋线组SOCS3 mRNA 和蛋白相对表达量与空白组、肌肉层埋线+AG490 组、脂肪层埋线+AG490 组相比均明显降低。脂肪层埋线组JAK2、STAT3、LEP-R mRNA 和蛋白相对表达量升高与SOCS3 mRNA 和蛋白相对表达量降低的幅度均大于肌肉层埋线组。

综上所述，脂肪层及肌肉层穴位埋线可以通过JAK2/STAT3 信号通路使瘦素直接参与外周脂肪的调节，其机制是通过下调外周脂肪组织中SOCS3 mRNA 和蛋白相对表达量，上调外周脂肪组织中LEP-R、JAK2、STAT3 mRNA 和蛋白相对表达量，从而使瘦素直接参与外周脂肪细胞的自分泌代谢，包括抑制脂肪合成、诱导脂肪分解等一系列阻碍肥胖形成的作用，以达到降低单纯性肥胖大鼠体重的目的。通过本实验研究可知脂肪层穴位埋线组LEP-R、JAK2、STAT3 mRNA 和蛋白相对表达量升高与SOCS3 mRNA 和蛋白相对表达量降低的幅度均大于肌肉层埋线组，从而进一步印证课题组前期研究得出的脂肪层穴位埋线减肥效果优于肌肉层埋线。课题组对不同层次穴位埋线有较深入的研究，而近期有报道指出穴位埋线在降低腰臀比和体质量指数上，埋线时间间隔1 周的疗效优于2 周，且两者不良反应无明显差异[22]，故课题组接下来可向不同间隔时间穴位埋线方向进行探索。