特立帕肽对尿毒症腹膜透析大鼠钙磷代谢紊乱的作用及其机制探讨*

周仕群，黎海翔，陈岳尧

（海南医学院附属儋州市人民医院1.肾内科，2.中医科，海南儋州 571799）

尿毒症是慢性肾衰竭的终末期，主要特点是代谢性酸中毒及水电解质紊乱等，同时出现钙缺乏、磷过多等钙磷代谢紊乱的症状[1]。目前临床多采用腹膜透析法替代肾脏排泄治疗终末期肾病。但研究证实，长期腹膜透析会引发钙磷代谢紊乱，患者发生骨质疏松、骨骼畸形的风险明显增加，对机体造成二次伤害，因此探寻有效方法防治尿毒症腹膜透析钙磷代谢紊乱具有重要意义[2]。特立帕肽是人甲状旁腺激素类似物，能促进骨折愈合，对骨质疏松有一定治疗作用。既往研究显示，特立帕肽能够改善绝经后骨质疏松症患者骨代谢异常[3]。既往研究显示，抑制Wnt/β-catenin 通路活化能够减轻蛋白尿，延缓肾脏病进展，对尿毒症大鼠足细胞发挥保护作用[4]。李明翰等[5]研究显示，特立帕肽能够抑制Wnt/β-catenin 通路活化，促进去势小鼠骨吸收。

目前有关特立帕肽对尿毒症腹膜透析患者钙磷代谢紊乱的影响少见报道，因此本研究基于Wnt/β-catenin 通路，探究特立帕肽对尿毒症腹膜透析大鼠钙磷代谢紊乱的影响，以期为临床有效防治尿毒症腹膜透析患者骨质疏松提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

50 只SPF 级SD 雄性大鼠（6 周龄），体重190～220 g，平均（205±15）g，购自北京北生研生物制品有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0012，实验动物使用许可证号：SYXK（京）2021-0265。

1.2 主要试剂与仪器

特立帕肽（国药准字S20170004，上海联合赛尔生物工程有限公司），血肌酐、血尿素氮、血钙、血磷、甲状旁腺激素酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）试剂盒（武汉恒意赛生物科技有限公司）， 苏木精- 伊红（hematoxylin-eosin, HE）染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司），兔抗鼠Wnt、β-catenin 及β-肌动蛋白（β-actin）、HRP 标记山羊抗兔二抗（上海酶研生物科技有限公司）。

Optima™XPN 超速离心机（美国贝克曼库尔特生物科技有限公司），TENLIN-A 型组织匀浆机（江苏天祥仪器有限公司）。

1.3 尿毒症腹膜透析大鼠模型的复制及分组

采用肾脏切除法复制尿毒症大鼠模型。50 只大鼠适应性喂养1 周后行左肾2/3 切除手术。以10%水合氯醛麻醉大鼠，背部左侧肾脏处备皮、消毒，切口露出左肾。剥离左肾周围脂肪组织，用带针丝线结扎肾脏上端1/3 并切除、止血，同样方法切除肾脏下端1/3，无出血后缝合肌层和皮肤，期间用青霉素消毒。1 周后行右肾全切手术，同切除2/3 左肾方法暴露右肾，直接结扎肾蒂处，右肾全切，无出血后缝合肌层和皮肤，期间用青霉素消毒。取尾静脉血测肌酐值≥2 倍的正常血肌酐时为尿毒症模型复制成功[6]。

尿毒症模型复制过程中死亡2只大鼠，剩余48只大鼠成功复制尿毒症模型。随机取12 只尿毒症大鼠为尿毒症组，剩余36 只大鼠随机分为尿毒症腹膜透析假手术组、尿毒症腹膜透析组、特立帕肽组，每组12 只。其中，尿毒症腹膜透析假手术组只进行开腹后缝合操作并腹腔插腹膜透析管；尿毒症腹膜透析组、特立帕肽组后腹腔插腹膜透析管，1.5%百特腹膜透析液2 mL 灌注，1 次/d，复制尿毒症腹膜透析大鼠模型，以肝素冲洗腹膜透析管通畅为尿毒症腹膜透析大鼠模型复制成功。

1.4 给药方式

特立帕肽组大鼠成功复制尿毒症腹膜透析模型后，腹腔注射特立帕肽30 μg/（kg·d）[7]，1 次/d，连续6 周；尿毒症组、尿毒症组腹膜透析组、尿毒症组腹膜透析假手术组同时间腹腔注射等量生理盐水。

1.5 方法

1.5.1 标本采集给药结束后，10%水合氯醛麻醉大鼠，取尾静脉血，3 000 r/min 离心10 min，取血清置入-20℃冰箱冷冻保存。取血结束后将大鼠断颈处死，取大鼠剩余肾脏分为两部分，一部分固定于4%多聚甲醛溶液，乙醇脱水、透明、石蜡包埋过夜，制备4 μm 厚组织切片用于病理检查；另一部分保存于液氮中用于Western blotting 检测。

1.5.2 ELISA 测定肾功能和钙磷代谢指标取各组大鼠血清，按照肾功能指标（血肌酐、血尿素氮）、钙磷代谢指标（血钙、血磷）ELISA 试剂盒说明书测定各指标水平[8]。

1.5.3 HE 染色观察肾组织病理学变化取各组大鼠肾组织切片，乙醇脱蜡至水，二甲苯透明，按照HE 染色试剂盒说明书进行染色，中性树胶封片。光学显微镜观察并采集图片，使用Image-Pro Plus 6.0 软件观察肺组织病理学变化[9]。

1.5.4 Western blotting测定肾组织Wnt/β-catenin通路蛋白的表达取各组大鼠肾组织并制备匀浆，裂解，孵育20 min，3 000 r/min 离心10 min，离心半径8 cm，取上清液，测定蛋白总量并取20 μg 与等量上样缓冲液混匀，沸水浴变性，电泳、转膜，以5%脱脂奶粉封闭2 h，TBST 清洗，加入Wnt、β-catenin及内参β-actin 作为一抗（1∶500），4℃孵育过夜，TBST 洗涤，加入山羊抗兔二抗（1∶1 000），37℃、1.5 h，显影、定影，以蛋白条带灰度值计算目的蛋白相对表达量[10]。

1.6 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用方差分析，进一步两两比较用SNK-q检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血肌酐及尿素氮水平比较

尿毒症组、尿毒症腹膜透析假手术组、尿毒症腹膜透析组、特立帕肽组大鼠血肌酐、血尿素氮水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=32.935 和73.147，均P=0.000）。进一步两两比较结果：与尿毒症组、尿毒症腹膜透析假手术组比较，尿毒症腹膜透析组、特立帕肽组大鼠腹膜透析血肌酐、血尿素氮水平升高（P＜0.05）；且特立帕肽组大鼠血肌酐、血尿素氮水平低于尿毒症腹膜透析组（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠血肌酐、血尿素氮水平比较（n=12，μmol/L，x±s）

2.2 各组大鼠血钙、血磷水平比较

尿毒症组、尿毒症腹膜透析假手术组、尿毒症腹膜透析组、特立帕肽组大鼠血钙、血磷水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=32.597和50.278，均P=0.000）。进一步两两比较结果：与尿毒症组、尿毒症腹膜透析假手术组比较，尿毒症腹膜透析组、特立帕肽组大鼠血钙水平降低（P＜0.05），血磷水平升高（P＜0.05）；且特立帕肽组大鼠血钙水平高于尿毒症腹膜透析组（P＜0.05），血磷水平低于尿毒症腹膜透析组（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠血钙、血磷水平比较（n=12，mmol/L，±s）

表2 各组大鼠血钙、血磷水平比较（n=12，mmol/L，±s）

注：①与尿毒症组、尿毒症腹膜透析假手术组比较，P ＜0.05；②与尿毒症腹膜透析组比较，P ＜0.05。

血磷0.95±0.15 1.45±0.22 2.16±0.33①1.79±0.27①②50.278 0.000组别尿毒症组尿毒症腹膜透析假手术组尿毒症腹膜透析组特立帕肽组F值P值血钙2.57±0.39 2.13±0.32 1.37±0.21①1.82±0.28①②32.597 0.00

2.3 各组大鼠肾组织病理学变化

尿毒症组、尿毒症腹膜透析假手术组大鼠可见肾小管结构完整且正常；尿毒症腹膜透析组大鼠肾小管毛细血管衰减严重，肾小管结构及形状发生明显改变；与尿毒症腹膜透析组比较，特立帕肽组大鼠上述病理变化有所改善。见图1。

图1 各组大鼠肾组织病理学变化 （HE染色×200）

2.4 各组大鼠肾组织Wnt/β-catenin 通路蛋白相对表达量比较

尿毒症组、尿毒症腹膜透析假手术组、尿毒症腹膜透析组、特立帕肽组大鼠肾组织Wnt、βcatenin 蛋白相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=115.316 和135.045，均P=0.000）。进一步两两比较结果：与尿毒症组、尿毒症腹膜透析假手术组比较，尿毒症腹膜透析组、特立帕肽组大鼠肾组织Wnt、β-catenin 蛋白相对表达量降低（P＜0.05）；且特立帕肽组大鼠肾组织Wnt、βcatenin 蛋白相对表达量低于尿毒症腹膜透析组（P＜0.05）。见表3和图2。

表3 各组大鼠肾组织Wnt/β-catenin通路蛋白相对表达量比较 （n=12，±s）

表3 各组大鼠肾组织Wnt/β-catenin通路蛋白相对表达量比较 （n=12，±s）

注：①与尿毒症组、尿毒症腹膜透析假手术组比较，P ＜0.05；②与尿毒症腹膜透析组比较，P ＜0.05。

β-catenin蛋白0.96±0.15 0.60±0.09 0.31±0.05①0.28±0.05①②135.045 0.000组别尿毒症组尿毒症腹膜透析假手术组尿毒症腹膜透析组特立帕肽组F 值P 值Wnt蛋白2.63±0.41 2.70±0.43 1.15±0.18①0.81±0.13①②115.316 0.000

图2 各组大鼠肾组织Wnt/β-catenin通路蛋白的表达

3 讨论

尿毒症是各种慢性肾衰竭终末期阶段，慢性肾衰竭患者肾功能发生不可逆性衰退，使代谢及毒性物质无法及时排出体外，在血液中积累造成全身中毒症状，导致尿毒症的发生。尿毒症临床症状主要表现为钙磷代谢紊乱、代谢性酸中毒和水钠潴留等[11]。目前腹膜透析是缓解尿毒症的主要方式，但患者需坚持透析不能中断。有研究表明，长期腹膜透析可引发钙磷代谢紊乱，患者易发生骨质疏松，给患者生活质量带来严重影响[12]。既往研究显示，特立帕肽能够促进骨质疏松性脊柱骨折愈合，改善患者生存质量[13]。

肌酐是人体肌肉代谢产物，其浓度升高多反映肾脏受损，能较准确地反映肾实质受损情况；尿素氮是一种含氮化合物，血肌酐和血尿素氮由肾小球过滤排出体外，两者均是检测肾功能的常用指标[14]。本研究结果显示，与尿毒症组、尿毒症腹膜透析假手术组比较，尿毒症腹膜透析组大鼠血肌酐、血尿素氮水平升高；当以特立帕肽药物干预后，大鼠血肌酐、血尿素氮水平均一定程度降低，说明特立帕肽可能改善尿毒症腹膜透析大鼠肾功能。钙、磷是人体必需元素，钙含量降低时患者易发生骨质疏松，磷含量升高时会导致身体钙流失，严重情况下引起机体中毒[15]。本研究结果显示，与尿毒症组、尿毒症腹膜透析假手术组比较，尿毒症腹膜透析组大鼠血钙水平降低，血磷水平升高；当以特立帕肽药物干预后，大鼠血钙水平一定程度升高，血磷水平一定程度降低，说明特立帕肽可能改善尿毒症腹膜透析大鼠钙磷代谢紊乱。

Wnt/β-catenin 通路存在于各种组织中，参与细胞增殖、分化、凋亡、癌变等病理生理过程。当机体受到刺激后，Wnt 蛋白与膜受体卷曲蛋白家族受体结合，激活细胞质内一系列蛋白，使通路中关键蛋白β-catenin 在细胞质内大量累积并转移入细胞核，调控组蛋白伸展、甲基化等，进而调控基因转录、细胞增殖及分化等[16-18]。姚瑶等[4]等研究表明，抑制Wnt/β-catenin 通路活化对脓毒症具有一定治疗作用。另有研究显示，抑制Wnt/βcatenin 通路活化对慢性肾衰竭大鼠肾功能有保护作用[19]。本研究结果显示，与尿毒症组、尿毒症腹膜透析假手术组比较，尿毒症腹膜透析组大鼠肾组织Wnt、β-catenin 蛋白相对表达量降低，当以特立帕肽干预后，大鼠肾组织Wnt、β-catenin 蛋白相对表达量均一定程度降低，说明特立帕肽可能通过抑制Wnt/β-catenin 通路活化，改善尿毒症腹膜透析大鼠肾功能，进而改善大鼠钙磷代谢紊乱。

综上所述，特立帕肽可改善尿毒症腹膜透析大鼠肾功能，提高血清钙、磷水平，进而改善尿毒症腹膜透析大鼠钙磷代谢紊乱，其作用可能是通过抑制Wnt/β-catenin 通路活化来实现的，可为临床有效防治尿毒症腹膜透析患者骨质疏松提供一定理论依据。然而本研究并未能明确特立帕肽对Wnt/β-catenin 通路的具体调控作用，后期将进行深入研究。