血清H2S水平与绝经后女性骨质疏松性脊柱骨折愈合的相关性分析*

汤 波,陈 演,黄 涛

1.文昌市人民医院运动医学科，海南文昌571300；2.海南医学院第一附属医院骨科，海南海口 570102

骨质疏松是绝经后女性人群最常见的骨代谢紊乱性疾病，与脊柱或髋骨骨折风险高有关[1]。无畸形愈合和尽快恢复肢体功能是骨折治疗的目标。迄今为止，骨折愈合的详细病理生理机制尚未完全澄清。以往的研究表明，破骨细胞的活化和成骨细胞的失活共同促进各种骨疾病的发展和骨折愈合进展，而这个过程受到多种细胞因子的调节例如硫化氢(H2S)[2-3]。H2S是一种普遍存在的气体递质，在骨转化和骨代谢过程中发挥着重要作用[4]。据研究报道，H2S能够降低尼古丁或脂多糖诱导的破骨细胞分化和破骨细胞祖细胞分化，在骨愈合过程中减少坏死性骨吸收，但有利于骨质疏松症。此外，H2S还会降低骨质中基质金属蛋白酶的活性，从而加速骨质矿化；或者通过减少糖皮质激素的分泌、抑制糖皮质激素受体α的活性来拮抗骨折后钙、磷的流失等[5]。鉴于H2S在骨代谢和骨重建中的重要性，本研究旨在初步探讨血清H2S水平与绝经后女性骨质疏松性脊柱骨折愈合之间的关系，从而为明确H2S在促进骨折愈合中的治疗潜力提供临床证据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年1月至2020年6月在文昌市人民医院(简称“本院”)收治的112例脊柱骨折的女性患者，经诊断均属于新鲜骨质疏松性椎体骨折(OVF)作为OVF组，OVF组楔形骨折76例、凹陷/双凹陷骨折36例，未见压缩性骨折。OVF组另根据骨折后4个月时的复查情况，分为骨愈合组32例、骨不愈合组80例。纳入标准：(1)年龄≥50岁且绝经超过1年的女性；(2)均进行双能X线吸收法(DXA)骨密度(BMD)检查和生化指标测定；(3)椎体骨折经影像学检查和磁共振显像确诊，且无椎弓根破坏、椎体后缘骨皮质完好。排除标准：(1)因高能量损伤(车祸等)造成的骨折或为继发性骨质疏松、原发性及转移性肿瘤引起的病理性脊柱骨折；(2)可能影响骨代谢的疾病患者，如转移性骨癌、原发性甲状旁腺功能亢进、甲状腺功能障碍、多发性骨髓瘤、骨软化、肾功能障碍、全身性感染疾病、口服药物(包括糖皮质激素、性激素、华法林和双膦酸盐等)；(3)精神疾病。在本院健康体检中心招募100例无精神类疾病、无低能量骨折、无中风病史、无骨质疏松明确证据的绝经后女性人群100例作为对照组1；另选取同期因跌倒入院检查，且无精神类疾病、无低能量骨折、无中风病史的绝经后骨质疏松女性人群106例作为对照组2。OVF组均接受球囊扩张椎体后凸成形术等手术治疗及常规药物治疗。3组在性别、年龄和骨密度比较，差异无统计学意义(P>0.05)。各组均有社会人口统计学、人体测量学数据，临床诊断、合并症、在急诊48 h内的实验室数据(包括骨代谢标志物、血清H2S等基线评估)，且对OVF组进行了为期1年的随访。本研究通过了本院伦理委员会的批准。

1.2方法

1.2.1血清骨转换标志物和H2S水平检测 OVF组在本院急诊室隔夜禁食后采集血样。对照组1和对照组2同样采集空腹静脉血样本。样品立即离心，在-80 ℃下保存，直至用于酶联免疫吸附试验(ELISA)检测。采用全自动电化学发光系统(Copas6000型、德国罗氏诊断公司)测定了血清骨转换标志物，包括β胶原降解产物(β-CTX)、血清1型前胶原氨基端肽(P1NP)。另外应用改良亚甲基蓝法测定H2S，即在血清样品中加入Zn2+用于沉淀H2S、HS-、S2-及血浆蛋白，然后用氢氧化钠重新溶解血浆蛋白。使用N,N-二甲基对苯二胺重新溶解沉积的ZnS，使用三氯乙酸沉淀残余蛋白，在4 ℃环境下以12 000×g转速离心5 min，取上清液加入10%硫酸铁铵充分振荡后，室温静置5～15 min生成亚甲基蓝，分光光度计在665 nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线，检测血清H2S水平。所有的实验室评估都是在骨折后2 d内进行的，并在骨折后4 d、7 d、14 d、1个月、2个月、12个月时分别检测骨愈合情况及血清β-CTX、P1NP、H2S水平。

1.2.2BMD测定 使用GE Lunar iDXA(Hologic公司，软件版本为16.0版，美国)进行DXA扫描，用于BMD评估，并记录腰椎(L1～L4) 、股骨颈的T和Z值，如果OVF患者接受腰椎手术，将排除受累椎骨，在分析中考虑上或下非受累椎骨。2016—2020年使用GE Lunar iDXA通过对同一丙烯酸包覆的铝脊柱L1～L4扫描>300次，以达到质量控制，变异系数(CV)<1%。同时为减少评估差异性，各组均由经过培训的专业医生按标准化程序进行，骨质疏松定义为T值≤-2.5标准差(s)，骨质减少定义为-2.5s

1.2.3骨愈合评估 在骨折后4个月时评估OVF组患者骨折愈合情况。脊椎活动度为X线测量的坐位与仰卧位之间椎体前缘高度变化。当OVF组脊椎活动度≤1.0 mm，且X线显示仰卧位无椎内裂隙视为骨折愈合。

2 结 果

2.13组临床资料比较 3组年龄、体质量指数(BMI)、绝经年龄、绝经时间、吸烟史、饮酒史、糖尿病史、高血压史、高脂血症史、冠心病史占比比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；但OVF组骨折后2 d血清P1NP、H2S水平高于对照组1和对照组2，OVF组骨折后2 d血清β-CTX水平、腰椎BMD及股骨颈BMD低于对照组1和对照组2，差异有统计学意义(P<0.05)；对照组2血清P1NP、H2S水平高于对照组1，腰椎BMD及股骨颈BMD则低于对照组1,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组临床资料比较

组别饮酒史占比[n(%)]糖尿病史占比[n(%)]高血压史占比[n(%)]高脂血症史占比[n(%)]冠心病史占比[n(%)]对照组115(15.00)18(18.00)36(36.00)45(45.00)16(16.00)对照组221(19.81)19(17.92)46(43.40)52(49.06)21(19.81)OVF组26(23.21)27(24.11)43(38.40)47(41.96)24(21.43)F/χ2/H2.2811.7051.2411.1101.045P0.3200.4260.5380.5740.593

组别β-CTX [M(P25,P75),ng/mL]P1NP[M(P25,P75),ng/mL]腰椎BMD(x±s,g/cm2)股骨颈BMD(x±s,g/cm2)H2S(x±s,μmol/L)对照组10.48(0.41,0.70)29.20(19.86,41.35)1.19±0.231.06±0.318.97±2.20对照组20.66(0.52,0.85)a31.60(23.75,47.14)a1.04±0.29a0.96±0.24a16.55±8.05aOVF组0.77(0.58,0.93)a38.19(29.34,67.87)ab0.93±0.29ab0.69±0.22ab28.39±7.22abF/χ2/H8.794-7.82324.10559.256246.205P0.0010.009<0.001<0.001<0.001

2.2OVF组血清H2S水平与骨折潜在危险因素的相关性 经Pearson相关分析，OVF组骨折后2 d血清H2S水平与血清β-CTX(r=0.342，P<0.001)和P1NP(r=0.505，P<0.001)水平呈正相关，而与股骨颈BMD呈负相关(r=-0.602，P<0.001)，但是与其年龄(r=-0.149，P=0.260)、BMI(r=-0.281，P=0.076)均无相关性。使用多元线性回归模型分析，进一步校正其他混杂因素后，发现骨折后2 d血清H2S水平是股骨颈BMD的独立预测因子(β=0.462，P=0.002)。

2.3OVF组血清H2S水平变化 OVF组骨折后7 d血清H2S水平[(56.19±14.40)ng/mL]与其骨折后2 d血清H2S水平[(28.39±7.22)ng/mL]比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与骨折后2 d血清H2S水平比较，OVF组骨折后4 d血清H2S水平升高至40.08%，骨折后7 d血清H2S水平百分比升高至97.92%。OVF组骨折后14 d、1个月、2个月血清H2S水平比骨折后2 d血清H2S水平略有升高，差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

图1 随访期间OVF组血清H2S水平变化

2.4两组不同时间点血清H2S水平比较 两组不同时间点血清H2S水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；两组骨折后7 d血清H2S水平高于其他时间点，差异有统计学意义(P<0.05)。骨不愈合组各时间点血清H2S水平均低于骨愈合组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 两组不同时间点血清H2S水平比较

2.5单因素和多因素Logistic回归分析影响绝经后女性骨质疏松性脊柱骨折患者骨折愈合情况的临床因素 经单因素和多因素Logistic回归分析，骨折后7 d血清H2S水平是绝经后女性骨质疏松性脊柱骨折患者骨折愈合受损的独立影响因素(P<0.05)。见表3。

表3 单因素和多因素Logistic回归分析影响绝经后女性骨质疏松性脊柱骨折的骨折愈合情况的临床因素

续表3 单因素和多因素Logistic回归分析影响绝经后女性骨质疏松性脊柱骨折的骨折愈合情况的临床因素

3 讨 论

女性绝经后极易患有骨质疏松症，骨质疏松症易并发脊柱、髋部等部位骨折，并且骨质疏松在增加绝经后女性骨折风险的同时，也增加了骨折愈合的难度。脊柱骨折不愈合可导致椎体前柱进行性缩短，加重患者胸腰椎后凸畸形，使患者产生持续性腰背疼痛、平衡能力及活动障碍等症状，严重影响着患者的生存质量[6-7]。目前临床已发现H2S在骨代谢及骨转化中起重要作用，影响着患者骨折愈合。本研究对比了发生骨质疏松性脊柱骨折绝经后女性患者及未发生骨折的绝经后女性的血清H2S水平。尽管OVF组骨折后2 d血清H2S水平与β-CTX、P1NP水平、股骨颈BMD都有一定的相关性，但进一步校正其他混杂因素后，骨折后7 d时血清H2S水平仍然是预测绝经后女性骨质疏松性脊柱骨折患者骨折愈合受损的独立影响因素，说明血清H2S水平影响着绝经后女性BMD。

骨质疏松症的发生是因骨吸收与骨形成之间的不平衡，其特征表现为骨量低、骨微结构破坏，致使骨脆性增加、骨强度降低[8]。老年人群因机体代谢功能的衰退，常发生骨代谢异常，因此骨质疏松在老年人群中的发生率更高，此外女性绝经后卵巢功能不断衰退，雌激素水平降低，导致女性骨质疏松发生率显著高于男性[9]。而且雌激素缺乏会增强炎性细胞因子的表达，从而抑制成骨细胞的活性及分化，同时刺激破骨细胞活性、减少细胞凋亡，不仅增加骨质疏松症的发生风险；而且也会导致骨强度降低、骨脆性增加[10-11]。因此绝经后女性极易发生骨质疏松性骨折。本研究中OVF组患者的腰椎、股骨颈BMD也明显低于对照组患者，同时血清P1NP水平高于对照组，说明低BMD和高P1NP可能为绝经后女性更易在低能量损伤下发生骨折。不管年龄和健康状况如何，骨转换包括骨吸收和骨形成两个过程。在骨吸收过程中，破骨细胞会在骨骼的不同部位移除少量的骨质，从而形成骨吸收腔。这个过程持续4～6周，在此期间，骨组织成分被分解并释放到骨微环境中，并进一步进入循环血液和尿液。因此血液和尿液中骨组分或分解代谢产物的数量(如β-CTX)反映了骨吸收活性[12]。随后，成骨细胞到达新形成的凹陷处开始骨形成。成骨细胞分泌骨样分子(例如P1NP)填充空腔，这是一种富含胶原蛋白的结缔组织，这些分子被释放到循环系统中。血液中成骨细胞释放的分子浓度(骨形成标志物)反映了骨形成活动[13]。

H2S是一种气体递质，内源性H2S主要由胱硫氨酸γ-裂解酶(CSE)、胱硫醚-β合成酶(CBS)在转硫作用中产生，有研究通过对人BM基质细胞使用17b-雌二醇进行体外处理，发现雌激素可上调CBS及CES的水平，进而生成H2S，这可能与绝经后女性患骨质疏松症相关[14]。这也解释了为何在本研究中对照组绝经后骨质疏松女性人群血清H2S水平较非骨质疏松对照女性人群普遍升高。H2S被证明可通过多途径参与骨组织再生及修复过程，既往研究认为H2S对骨折愈合有积极意义[15]，如H2S抑制活性氧信号的直接和间接机制是通过触发核因子E2相关因子2依赖的抗氧化反应，从而抑制破骨细胞分化，并且在缺氧、氧化性损伤等应激状态下，H2S可增加骨髓间充质干细胞及其他类型细胞的增殖及活性。ZHENG等[16]发现CSECSE-H2S系统通过硫化作用提高了runt相关转录因子2的活性，从而促进骨基质形成和骨折愈合；BEHERA等[14]也提到CBS缺乏型小鼠血清及细胞内H2S水平降低，致使小鼠发生严重骨质疏松症。本研究OVF组骨折后2 d血清H2S水平与β-CTX、P1NP水平、股骨颈BMD都有一定的相关性，说明在骨折早期H2S应激性合成增加，并且积极参与了骨转化过程。MA等[5]曾证实过H2S对糖皮质激素导致的继发性骨质疏松症大鼠的治疗作用，其研究团队认为外源性H2S通过激活Wnt/β-catenin信号通路，减弱了地塞米松诱导的成骨细胞增殖和成骨分化的抑制作用，同时还能保护成骨细胞的活性，防止地塞米松诱导的细胞凋亡。本研究两组骨折后7 d血清H2S水平高于其他时间点，且骨不愈合组在各时间点血清H2S水平均低于骨愈合组，说明内源性血清H2S水平在骨折早期应激性升高对促进骨折愈合有积极意义。而且经单因素和多因素Logistic回归分析证实了骨折后7 d时血清H2S水平是绝经后女性骨质疏松性脊柱骨折患者骨折愈合受损的独立影响因素。

综上所述，血清H2S水平与绝经后女性骨质疏松性脊柱骨折患者骨折愈合情况有一定相关性，内源性H2S升高可促进骨组织的再生及修复，有利于骨折愈合。绝经后女性发生骨质疏松性脊柱骨折后7 d血清H2S的低水平可能是增加患者发生骨折愈合受损风险的重要因素。建议对血清H2S水平进行深入研究，为改善绝经后女性骨折愈合提供更佳治疗方案。