Galectin-9在多发性骨髓瘤患者Th17/Treg失衡中的意义

潘 鑫,王 娟,徐冬云,张亚辉,徐永茂

中国人民解放军陆军第七十一集团军医院肿瘤血液科，江苏徐州 221000

多发性骨髓瘤(MM)是一种近年来发病率逐渐升高的血液系统肿瘤，好发于中老年人[1]。MM以分泌异常的单克隆浆细胞在骨髓内大量增殖为主要特征，其发生发展与机体免疫状态密切相关，特别是与T淋巴细胞亚群有关。调节性T细胞(Treg)和辅助性T细胞 17(Th17)均为重要的T淋巴细胞亚群，前者可控制自身免疫疾病和抑制肿瘤免疫反应起到抗炎作用，后者主要通过分泌白细胞介素-17(IL-17)而起到促炎作用，两者在细胞分化及功能作用上相互抑制，共同维持机体局部免疫平衡[2-3]。已有学者发现，MM患者体内存在明显的Th17/Treg失衡,表现为Th17细胞比例升高和Treg细胞比例降低，且有多种因子参与其中[4]。半乳糖凝集素9(Galectin-9)是一种急性髓系白血病、恶性淋巴瘤等血液系统肿瘤中表达异常的半乳糖凝集素，主要参与细胞聚集黏附、机体免疫调节等过程。相关研究显示，Galectin-9可与其配体T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3(Tim-3)结合，在机体免疫效应阶段清除效应Th17细胞、抑制T细胞介导免疫反应作用，推测其可能通过与Tim-3作用而参与了Th17/Treg失衡过程[5]。本次研究通过检测MM患者外周血Th17、Treg细胞水平及Galectin-9表达情况，探讨Galectin-9在MM患者Th17/Treg失衡中的作用及与临床病理关系，以期为临床判断MM病情进展及预后提供一定参考。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2020年1月至2021年6月本院收治的105例初诊MM患者(MM组)作为研究对象。纳入标准：(1)参考文献[6]确诊为MM的初诊患者，采血前未进行过放化疗、免疫靶向治疗等；(2)不伴其他浆细胞相关疾病；(3)研究对象知情并签署同意书。排除标准：(1)急慢性感染性疾病；(2)传染性疾病；(3)自身免疫性疾病、恶性肿瘤等或其他血液疾病。另选同期在本院体检健康人员61例作为对照组，同样排除急慢性感染性疾病、自身免疫性疾病、传染性疾病、恶性肿瘤等或其他血液疾病。MM组男67例、女38例，年龄35～75岁、平均(54.76±8.72)岁；对照组男40例、女21例，年龄40～72岁、平均(55.12±8.34)岁。两组患者性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经本院医学伦理委员会审核通过。

1.2方法

1.2.1Galectin-9、Tim-3 mRNA相对表达水平检测 采集MM组患者入院次日、对照组体检当日空腹静脉血6 mL，取4 mL于抗凝管中保存，用于分离单个核细胞(PBMC)：将全血与等体积磷酸盐缓冲液(PBS)混匀，加入淋巴细胞分离液，以2 000 r/min进行密度梯度离心，吸取中间白色絮状细胞层，为PBMC。在提取的PBMC中加入Trizol试剂提取总RNA，并检测RNA浓度。采用SYBR@ Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒(日本宝日医生物技术有限公司)进行RT-PCR反应，扩增反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，40个循环，60 ℃ 30 s退火。内参选用β-action，以2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达水平。引物为Galectin-9：上游5′-CTTTCATCACCACCATTCTG-3′，下游5′-ATCTGGAACCTCTGAGCACTG-3′；Tim-3：上游5′-CAGATACTGGCTAAATGGG-3′，下游5′-CTTGGCTGGTTTGATGAC-3′；β-action：上游5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′，下游5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′。

1.2.2外周血CD4+T、Th17、Treg水平检测 采用流式细胞仪(BD公司，FACSCalibur型)检测，采用全血法配置分析液，FACS Multi SET程序获得CD4+T水平，采用BD Cell Quest软件分析测定CD4+T中Th17、Treg水平，并计算Th17/Treg比例，试剂盒来自美国罗氏公司。

1.2.3血清IL-17、IL-10水平检测 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)：取2 mL全血以3 500 r/min离心10 min后取上清液冻存用于ELISA检测，将ELISA试剂盒室温静置30 min，按照需要浓度稀释标准品，在各孔中加入血清100 μL和标准品，36 ℃作用90 min，空白孔加入通用的稀释液及标准品，洗板后在各反应孔加入生物素化抗体100 μL，空白孔加入抗体稀释液，作用60 min，洗板后各反应孔加入100 μL酶标抗体，空白孔加入酶结合物稀释液，作用30 min，洗板后各孔加入100 μL 3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)显色，作用15 min，随后加入100 μL终止液，在3 min内采用酶标仪读取各标本吸光度(A值)，并根据标准品浓度及对应A值绘制标准曲线。

2 结 果

2.1两组外周血Galectin-9、Tim-3 mRNA表达情况 MM组Galectin-9、Tim-3 mRNA相对表达水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。Pearson相关性分析显示，Galectin-9 mRNA与Tim-3 mRNA表达呈正相关(r=0.376，P=0.005)。

表1 两组外周血CD4+T细胞上Galectin-9表达情况

2.2两组外周血T淋巴细胞亚群表达情况 MM组患者外周血Th17、Th17/Treg高于对照组，Treg水平低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。Pearson相关性分析显示，Galectin-9 mRNA与Th17、Th17/Treg表达呈正相关(r=0.491、0.389，P<0.05)，与CD4+T、Treg表达呈负相关性(r=-0.408、-0.477，P<0.05)。

表2 两组外周血T淋巴细胞亚群表达情况

2.3两组血清IL-17、IL-10水平及IL-17/IL-10比值比较 MM组血清IL-17、IL-10水平及IL-17/IL-10比值均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 两组血清IL-17、IL-10水平及IL-17/IL-10比值比较

2.4MM患者Galectin-9 mRNA表达与临床病理关系 MM患者Galectin-9 mRNA随ISS分期、DS分期增加而逐渐增高，见表4。Spearman相关性分析显示，Galectin-9 mRNA与ISS分期、DS分期呈正相关(r=0.604、0.605，P<0.001)；染色体异常、血清游离轻链比值(sFLCR)异常患者Galectin-9 mRNA分别高于染色体正常、sFLCR正常患者，Pearson相关性分析显示，Galectin-9 mRNA与染色体、sFLCR呈正相关(r=0.630、0.662，P<0.001)。

表4 MM患者Galectin-9 mRNA与临床病理关系

续表4 MM患者Galectin-9 mRNA与临床病理关系

3 讨 论

MM是以浆细胞大量增殖为主要特性的恶性血液系统肿瘤，患者体内存在明显的T淋巴细胞数量和功能异常。相关研究显示，与健康人群相比，MM患者体内存在CD4+T细胞水平抑制[7]。还有学者发现无论初诊或复发MM患者体内均存在明显的Th17/Treg比例偏高[8]。Treg细胞是一类在多种恶性肿瘤及免疫性疾病中表达异常的淋巴细胞，主要起到抑制效应T细胞和维持自身免疫耐受作用，目前其在MM中表达存在争议[9]。Th17细胞因具有促炎作用而被认为在MM的溶骨性病变中起到促进病程作用，而在MM中表达情况也并未达成共识[10]。这可能与MM患者个体微环境、疾病进程等多种因素有关。本次研究结果显示，MM患者外周血Th17占比明显偏高，而Treg占比偏低，引发Th17/Treg失衡，且平衡向Th17方向移动，提示Th17在MM发病过程中起作用。IL-17是Th17特异性分泌的细胞因子，能促进初始T淋巴细胞向Th17细胞分化，在众多自身免疫疾病或恶性肿瘤中高表达。相关研究显示，Treg细胞能通过分泌IL-10、TGF-β等因子来发挥免疫抑制作用[11]。本次研究中显示MM患者IL-17、IL-10水平及IL-17/IL-10比值均高于健康人群，进一步证实了MM中存在向Th17偏移。有学者认为Th17、IL-17的表达增加是骨髓瘤细胞与其所处微环境相互作用结果[12]。还有研究认为Th17能通过分泌相关细胞因子与恶性肿瘤细胞结合，在促进肿瘤血管生成、骨质破坏等过程中起到重要作用[13]。本次研究中MM患者IL-10表达也升高，这可能与IL-10能引发免疫抑制，促进肿瘤细胞免疫逃逸有关。而IL-17/IL-10比值偏高提示MM患者体内存在IL-17/IL-10比值失衡引发的免疫紊乱，且以Th17细胞分泌的IL-17为优势，表现为促进骨髓瘤细胞增殖和免疫抑制作用。Galectin-9是一种串联重复的半乳糖凝聚素，其基因位于染色体17q11.1上，主要起到趋化嗜酸性粒细胞、免疫调节、促进肿瘤细胞侵袭转移等作用。相关研究显示，Galectin-9可与Th1细胞表面标记分子Tim-3结合，影响T细胞对IFN-γ的分泌，降低T细胞对肿瘤生长的抑制作用[14]。本研究显示，MM组Galectin-9、Tim-3 mRNA相对表达水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，提示Tim-3、Galectin-9均参与了MM发生发展过程。本次研究中血Galectin-9 mRNA与Tim-3 mRNA表达呈正相关，提示两者在MM中可相互影响。多项研究显示，Tim-3、Galectin-9共同参与了肿瘤浸润转移、血管形成、免疫逃逸等多过程调控，而Tim-3/Galectin-9通路能通过介导T细胞失能从而导致肿瘤的进展[15]。Tim-3目前已经被证实能参与Th17的免疫调控过程，且能耗尽机体CD4+T细胞和有效抑制Treg细胞的抗肿瘤免疫功能[16-17]。本研究中Galectin-9 mRNA表达与Th17、Th17/Treg表达呈正相关，与CD4+T、Treg表达呈负相关，提示Galectin-9同样参与了Th17/Treg失衡过程，而此过程可能是通过Galectin-9/Tim-3通路调节的。还有学者发现，Tim-3、Galectin-9与恶性肿瘤患者临床病理参数之间存在相关，两者高表达均可提示预后较差[18]。本次研究中MM患者Galectin-9表达与ISS分期、DS分期、染色体、sFLCR存在一定相关性。其中染色体异常及分期增加多提示预后不良；sFLCR提示克隆性浆细胞水平变化，此指标变化早于骨髓瘤细胞变化[19-20]，提示Galectin-9表达可在早期提示MM病情进展及预后，而此过程可能与Th17/Treg失衡情况密切相关。综上所述，MM患者存在明显的外周血Galectin-9水平偏高及Th17/Treg失衡，Galectin-9可能通过调控Tim-3表达参与了Th17/Treg失衡及MM病情进展过程。